Identifisering av B-celleundergruppene som er ansvarlige for anti-pneumokokkrespons (PNEUMOVACB)

Målet med denne studien er å identifisere hvilke spesifikke B-celleundersett(er) som er ansvarlige for produksjonen av beskyttende IgM, IgG2 og IgA anti-pneumokokk-kapselpolysakkarider (capPS) som respons på immunisering av friske individer med Pneumovax, en prototypisk T-uavhengig type 2-vaksine. Med andre ord, fra hvilke B-celler er IgM-, G2- og A-utskillende plasmaceller avledet? For å løse dette spørsmålet, vil det bli utnyttet av den unike Ig tungkjede VDJ-signaturen uttrykt av hver B-celleklon, og strategien vil stole på søk etter klonale filiasjoner mellom plasmablaster (PB)/plasmaceller (PC) og forskjellige B-celler underpopulasjoner. Derfor vil friske personer vaksineres med Pneumovax, og blodprøver vil bli tatt på dag 0, 7, 14, 28 og 56. Med utgangspunkt i disse blodprøvene, vil forskjellige B-celle-undergrupper (spesielt IgM+IgD+CD27+ og switched memory IgM-IgD-CD27+ B-celler) og PB/PC-toppen på dag 7 etter vaksinasjon isoleres ved cellesortering. CapPS-utskillende PB kan ikke isoleres spesifikt, men etterforskerne antar at de vil representere majoriteten av den isolerte PB/PC på toppen av responsen. Dermed vil dag 7-PB/PC sorteres både i bulk eller som enkeltceller i 96-brønners PCR-plater. RNA vil bli ekstrahert fra bulksorterte PB/PC, og VDJ-µ, -alfa og -gamma Ig-transkripter vil bli amplifisert ved RT-PCR og analysert med H-CDR-spektratypingsmetoden for å identifisere sekvensen av dominerende VDJ-signaturer som mest sannsynlig tilsvarer anti-capPS-utskillende celler. Parallelt, for hver enkelt PB/PC-celle, vil Ig-tung og tilsvarende Ig-lettkjede-gentranskripter bli amplifisert ved nestet RT-PCR, sekvensert, og forutsatt at den tunge kjeden inneholder en dominerende VDJ-signatur, vil de bli klonet til eukaryotisk ekspresjon vektorer for å produsere monoklonale humane Abs. De rekombinante antistoffene vil deretter bli testet for reaktivitet mot capPS fra vaksinen ved hjelp av ELISA. Når VDJ-signaturer av capPS vil bli validert, med dette kraftige molekylære verktøyet, vil etterforskerne se etter tilstedeværelsen av disse signaturene gjennom VDJ-spesifikk PCR på cDNA fremstilt fra de forskjellige B-celleundergruppene.