Identifikation af B-celleundergrupperne, der er ansvarlige for anti-pneumokokrespons (PNEUMOVACB)

Formålet med denne undersøgelse er at identificere, hvilke specifikke B-celle-undergrupper, der er ansvarlige for produktionen af ​​beskyttende IgM, IgG2 og IgA anti-pneumokok kapselpolysaccharider (capPS) som respons på immunisering af raske individer med Pneumovax, en prototypisk T-uafhængig type 2-vaccine. Med andre ord, fra hvilke B-celler er IgM-, G2- og A-udskillende plasmaceller afledt? For at løse dette spørgsmål vil det blive udnyttet af den unikke Ig tunge kæde VDJ-signatur udtrykt af hver B-celle klon, og strategien vil stole på søgningen af ​​klonale filiationer mellem plasmablaster (PB)/plasmaceller (PC) og forskellige B-celler delpopulationer. Derfor vil raske personer blive vaccineret med Pneumovax, og blodprøver vil blive udtaget på dag 0, 7, 14, 28 og 56. Med udgangspunkt i disse blodprøver, vil forskellige B-celle-undergrupper (især IgM+IgD+CD27+ og switched memory IgM-IgD-CD27+ B-celler) og PB/PC, der topper på dag 7 efter vaccination, blive isoleret ved cellesortering. CapPS-udskillende PB kan ikke isoleres specifikt, men efterforskerne antager, at de vil repræsentere størstedelen af ​​den isolerede PB/PC ved toppen af ​​responsen. Dag 7-PB/PC vil således blive sorteret både i bulk eller som enkeltceller i 96-brønds PCR-plader. RNA vil blive ekstraheret fra bulksorterede PB/PC, og VDJ-µ, -alfa og -gamma Ig transkripter vil blive amplificeret ved RT-PCR og analyseret ved H-CDR spektratypningsmetoden for at identificere sekvensen af ​​dominerende VDJ signaturer, der svarer sandsynligvis til anti-capPS-udskillende celler. Parallelt hermed vil Ig tunge og tilsvarende Ig let kæde gentranskripter for hver PB/PC enkeltcelle blive amplificeret ved nestet RT-PCR, sekventeret, og forudsat at den tunge kæde indeholder en dominerende VDJ signatur, vil de blive klonet til eukaryotisk ekspression vektorer til at producere monoklonale humane Abs. De rekombinante antistoffer vil derefter blive testet for reaktivitet mod capPS fra vaccinen ved ELISA. Når VDJ-signaturer af capPS vil blive valideret, med dette kraftfulde molekylære værktøj, vil efterforskerne lede efter tilstedeværelsen af ​​disse signaturer gennem VDJ-specifik PCR på cDNA fremstillet fra de forskellige B-celle undergrupper.