A pneumococcus elleni válaszért felelős B-sejt-alcsoportok azonosítása (PNEUMOVACB)

Ennek a vizsgálatnak az a célja, hogy azonosítsa, mely specifikus B-sejt-alcsoport(ok) felelős(ek) a védő IgM, IgG2 és IgA anti-pneumococcus kapszuláris poliszacharidok (capPS) termeléséért egészséges egyének Pneumovax-szal, a. prototipikus T-független 2-es típusú vakcina. Más szóval, mely B-sejtekből származnak az IgM, G2 és A-szekretáló plazmasejtek? Ennek a kérdésnek a megválaszolásához kihasználják az egyes B-sejt klónok által kifejezett egyedi Ig nehézlánc VDJ aláírást, és a stratégia a plazmablasztok (PB)/plazmasejtek (PC) és a különböző B-sejtek közötti klonális filiációk keresésén alapul. alpopulációk. Ezért az egészséges egyéneket Pneumovax-szal oltják be, és a 0., 7., 14., 28. és 56. napon vérmintákat vesznek. Ezekből a vérmintákból kiindulva sejtválogatással izolálják a különböző B-sejt-alcsoportokat (különösen az IgM+IgD+CD27+ és a kapcsolt memória IgM-IgD-CD27+ B-sejteket), valamint a vakcinázást követő 7. napon csúcsot elérő PB/PC-t. A CapPS-t kiválasztó PB nem különíthető el specifikusan, de a kutatók feltételezik, hogy a válasz csúcsán az izolált PB/PC többségét képviselik. Így a 7. nap-PB/PC 96 lyukú PCR-lemezeken tömegesen vagy egyes sejtként is szétválogatásra kerül. Az RNS-t kivonják a tömegesen szétválogatott PB/PC-ből, és a VDJ-µ, -alfa és -gamma Ig transzkriptumokat RT-PCR-rel amplifikálják, és a H-CDR spektratipizálási módszerrel elemzik annak érdekében, hogy azonosítsák a domináns VDJ aláírások szekvenciáját. valószínűleg anti-capPS-kiválasztó sejteknek felel meg. Ezzel párhuzamosan minden egyes PB/PC egysejt esetében az Ig nehéz és a megfelelő Ig könnyű lánc gén átiratait beágyazott RT-PCR-rel amplifikálják, szekvenálják, és feltéve, hogy a nehéz lánc domináns VDJ aláírást tartalmaz, eukarióta expresszióba klónozzák. vektorok monoklonális humán Abs előállítására. A rekombináns antitesteket ezután ELISA-val teszteljük a vakcinából származó capPS elleni reaktivitásra. Amikor ezzel a hatékony molekuláris eszközzel validálják a capPS VDJ aláírásait, a kutatók VDJ-specifikus PCR-rel keresik ezeknek az aláírásoknak a jelenlétét a különböző B-sejt-alcsoportokból előállított cDNS-en.