Identifikace podskupin B buněk odpovědných za antipneumokokovou odpověď (PNEUMOVACB)

Cílem této studie je identifikovat, která specifická podskupina B buněk je zodpovědná za produkci ochranných IgM, IgG2 a IgA antipneumokokových kapsulárních polysacharidů (capPS) v reakci na imunizaci zdravých jedinců Pneumovaxem, a prototypová T-nezávislá vakcína typu 2. Jinými slovy, z jakých B buněk jsou odvozeny plazmatické buňky vylučující IgM, G2 a A? K vyřešení této otázky bude využita jedinečná signatura VDJ těžkého řetězce Ig exprimovaná každým klonem B buněk a strategie se bude opírat o hledání klonálních filiací mezi plazmablasty (PB)/plazmatickými buňkami (PC) a různými B buňkami. subpopulací. Proto budou zdraví jedinci očkováni Pneumovaxem a vzorky krve budou odebrány v den 0, 7, 14, 28 a 56. Počínaje těmito krevními vzorky budou tříděním buněk izolovány různé podskupiny B buněk (zejména IgM+IgD+CD27+ a IgM-IgD-CD27+ B buňky s přepnutou pamětí) a PB/PC vrcholící v den 7 po vakcinaci. PB sekretující CapPS nelze specificky izolovat, ale výzkumníci předpokládají, že budou představovat většinu izolovaných PB/PC na vrcholu odpovědi. Den 7-PB/PC se tedy třídí jak hromadně, tak jako jednotlivé buňky v 96-jamkových PCR destičkách. RNA bude extrahována z hromadně tříděných PB/PC a transkripty VDJ-µ, -alfa a -gama Ig budou amplifikovány pomocí RT-PCR a analyzovány metodou spektratypizace H-CDR, aby se identifikovala sekvence dominantních signatur VDJ, které s největší pravděpodobností odpovídají buňkám vylučujícím anti-capPS. Paralelně budou pro každou jednotlivou buňku PB/PC amplifikovány genové transkripty Ig těžkého a lehkého řetězce Ig pomocí nested RT-PCR, sekvenovány a za předpokladu, že těžký řetězec obsahuje dominantní VDJ signaturu, budou klonovány do eukaryotické exprese vektory pro produkci monoklonálních lidských Abs. Rekombinantní protilátky pak budou testovány na reaktivitu proti capPS z vakcíny pomocí ELISA. Když budou VDJ signatury capPS ověřeny, pomocí tohoto výkonného molekulárního nástroje budou výzkumníci hledat přítomnost těchto signatur pomocí VDJ-specifické PCR na cDNA připravené z různých podskupin B buněk.