Dynamique de la réponse immunitaire chez les enfants au vaccin polyosidique capsulaire antipneumococcique 23-valent (Pneumovax)

Les détails sont décrits ci-dessous :

1. Site d'étude Hôpital du district de Kilifi.
2. Population étudiée et échantillonnage Les cas et les témoins de la cohorte de naissance de Kilifi qui sont vivants à la fin de l'observation de la cohorte (à l'âge de 24 mois) et qui résident toujours dans le district de Kilifi seront vaccinés avec une seule dose sous-cutanée de 0,5 ml de 23 vaccin pneumococcique polysaccharidique valent (Pneumovax 23) pour comparer la dynamique de la réponse anticorps anti-capsulaire à 5 antigènes capsulaires choisis pour représenter différents profils immunologiques des polysaccharides capsulaires pneumococciques (1, 6B, 14, 19F, 23F).

3. Recrutement Les sujets potentiels de l'étude seront identifiés et leurs mères seront approchées, informées de l'étude, y compris de la nécessité de subir un test de dépistage du VIH, et invitées à y participer. Un agent de terrain expliquera les raisons et les procédures de l'étude et remettra à la mère une fiche d'information/formulaire de consentement à emporter. La mère recevra également un bordereau de rendez-vous et un titre de retour à l'hôpital à la date du rendez-vous. Les rendez-vous seront au service 1. Au retour de la mère, l'agent de terrain reprendra le formulaire de consentement et demandera à la mère de le signer. La mère sera conseillée et son enfant subira un test de dépistage du VIH. Si le participant est positif, l'enfant sera référé à la clinique familiale de Kilifi. Si le participant est négatif, l'enfant recevra la dose unique de Pneumovax (vaccin polyosidique 23 valent). La mère recevra un calendrier de 2 rendez-vous supplémentaires pour des tests sanguins et à chaque visite, le trajet aller-retour à l'hôpital sera fourni par KEMRI. Les sujets de l'étude qui ont été vaccinés et qui par la suite ne se présentent pas seront visités par FW à moto pour les inviter à respecter leurs rendez-vous dès le lendemain. Des informations seront collectées concernant l'âge, le sexe et les expositions environnementales telles que : le nombre de frères et sœurs plus âgés et plus jeunes dans la maison, l'exposition à la fumée de cuisson, le tabagisme passif, l'admission récente à l'hôpital.

   Définition des cas :

   Les cas d'IIP, d'IRA ou de pneumonie radiographique et de méningite seront définis comme des épisodes de maladie, nécessitant une hospitalisation, qui surviennent chez les membres de la cohorte entre la naissance et l'âge de 23 mois et qui répondent également à au moins l'une des définitions de syndrome suivantes : PNEUMOCOQUE INVASIF La MALADIE est définie par un résultat positif sur l'UN ou l'autre des critères suivants : (i) culture de S. pneumoniae à partir de tout site normalement stérile, y compris le sang, le LCR, les poumons, le liquide synovial, mais à l'exclusion du liquide de l'oreille moyenne et des écouvillons oculaires externes. OU (ii) Doublement de la concentration d'anticorps anti-PsaA mesurée par ELISA dans deux échantillons de sérum obtenus à au moins 5 jours d'intervalle 21 ET présence dans l'urine de polysaccharide capsulaire pneumococcique détectée par le test d'agglutination au latex 46. L'IRA est définie par des antécédents aigus (<2 semaines) de toux ou de difficultés respiratoires accompagnées d'une fréquence respiratoire élevée (≥50/min chez un enfant <12 mois, ≥40/min chez un enfant 12-23 mois). L'IRA est sévère s'il y a en plus un tirage sous-costal, et très sévère s'il y a en plus une cyanose centrale et une prostration ou une incapacité à boire 47.

   La PNEUMONIE RADIOGRAPHIQUE est définie comme une IRA accompagnée d'une consolidation radiographique. Toutes les radiographies seront évaluées à la fois par les médecins de l'étude et par un radiologue consultant. La "consolidation radiographique" ne sera considérée comme présente que si elle est documentée par les deux observateurs.

   MÉNINGITE : La définition de la méningite vise à cibler l'utilisation de tests diagnostiques supplémentaires pour les IIP. Il faut une définition sensible mais pas nécessairement hautement spécifique de la méningite à pneumocoque. Tout enfant qui est transféré à l'unité de dépendance élevée du KEMRI avec un diagnostic clinique de « méningite », tout enfant qui a commencé le régime antibiotique standard contre la méningite, ou tout enfant avec un nombre élevé de leucocytes dans le LCR ou un rapport LCR/glycémie < 0,5 sera considéré comme un cas de méningite aux fins de cette étude.

   Un seul épisode de maladie peut répondre à une, deux, trois ou toutes les définitions de cas. La définition de l'IPD est destinée à être utilisée dans l'étude cas-témoin. Les autres définitions sont destinées à être utilisées dans l'étude de l'incidence et de l'étiologie des IRA graves et des pneumonies radiographiques et à guider le flux d'investigations des patients suspects d'IIP.

4. Méthodes de laboratoire ANTI-CAPSULAR IGG ELISA. La méthode de Quataert et al. sera utilisé avec des modifications mineures 13,14. Des plaques de microtitrage à fond plat (Nunc Maxisorb, Nunc, Finlande) sont recouvertes de 20 μg/ml de polysaccharide capsulaire purifié (American Type Culture Collection, Manassas, Virginie, États-Unis) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 0,01 M, pH 7,2, pendant 5 heures à 37oC puis stocké à 4oC. Les plaques sont lavées cinq fois avec du PBS, pH 7,2, avec 0,05 % de Tween-20 après chaque étape. Les sérums à tester sont dilués au 1:50 dans de l'albumine de sérum bovin à 1 %, du Tween-20 à 0,05 % dans du PBS contenant 10 μg/ml de polysaccharide C (Statens Seruminstitut, Copenhague, Danemark) et 20 μg/ml de polysaccharide des sérotypes 22F (American Type Culture Collection) incubés pendant 30 minutes à température ambiante. Les sérums à tester sont aliquotés sur la plaque en double dans 8 dilutions au 1/3 et incubés à température ambiante pendant 1 heure. Un sérum standard de référence (89SF, Dr Carl Frasch, FDA, USA) et un contrôle (sérum post-vaccinal d'un individu ayant de bonnes réponses à tous les sérotypes vaccinaux) sont dosés sur chaque plaque en sept dilutions au 1/3. L'anticorps lié est marqué avec une IgG anti-humaine de chèvre conjuguée à la phosphatase alcaline dans une incubation de 2 heures à température ambiante. L'enzyme liée est visualisée avec du phosphate de p-nitrophényle dans un substrat de diéthanolamine (Sigma) pendant 2 heures à température ambiante et la réaction est arrêtée avec du NaOH 3M. Les plaques sont lues par un lecteur ELISA à une longueur d'onde de 450 nm avec un filtre de référence de 620 nm. Les résultats sont analysés par un programme d'ajustement de courbe logistique-log à 4 paramètres (ELISA v1.11, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA) et exprimés par rapport aux concentrations connues du sérum de référence.

   ELISA POUR ANTI-PSAA : La méthode de Tharpe et al. sera utilisé sur des paires ou des triples de sérums. Des plaques de microtitration à fond plat (Immunlon II HB, Dynatech Corp, Chantilly, VA) sont recouvertes de 2,5 μg/ml de PsaA purifiée dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 0,01 M, pH 7,2, pendant 16 heures à 4oC. PsaA est produit par recombinaison et expression dans Escherichia coli du gène codant pour PsaA. Les plaques sont lavées quatre fois avec du PBS, pH 7,2, avec 0,05 % de Tween-20 après chaque étape sauf le blocage, lorsque les plaques sont simplement vidées. Les plaques sont bloquées pendant 1 heure à 37°C avec 1 % d'albumine de sérum bovin (qualité EIA, Sigma Chemical Co., St Louise, MO) 10 mg/L dans du PBS. Les sérums à tester sont dilués dans de l'albumine de sérum bovin à 1 %, du Tween-20 à 0,05 % dans du PBS et incubés pendant 1 heure à 37 °C. Les sérums à tester sont dosés en double dans 8 dilutions au 1/2 et tous les sérums d'un patient sont dosés sur la même plaque. Un sérum de référence à haute concentration en anti-PsaA et un contrôle (Sandoglobulin, Sandoz, Suisse) sont dosés sur chaque plaque en sept dilutions au 1/2. L'anticorps lié est marqué avec une IgG-Fc monoclonale de souris anti-humaine conjuguée à de la peroxydase de raifort (clone PH6043, Hybridoma Reagent Laboratories, Baltimore, MD) dans une incubation de 2 heures à 37oC. L'enzyme liée est visualisée avec de la tétraméthylbenzidine (substrat de peroxydase de micropuits à 1 composant TMB, Kirkegaard et Perry Laboratories Inc, Gaithersburg, MD) pendant 30 minutes à température ambiante et la réaction est arrêtée avec de l'acide sulfurique 0,18 M. Les plaques sont lues par un lecteur ELISA à une longueur d'onde de 450 nm avec un filtre de référence de 620 nm. Les résultats sont analysés par un programme d'ajustement de courbe logistique-log à 4 paramètres (ELISA v1.11, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA) et exprimés en unités ELISA en pourcentage de la concentration du sérum de référence.

5. Conservation des données Les formulaires de recrutement et de suivi seront conservés dans un bureau d'étude fermé à clé. Les informations des formulaires seront saisies dans un ordinateur à l'aide de Filemaker Pro 5.5 et seront liées au numéro d'étude et à la visite avec les données du laboratoire.