Dinâmica da resposta imune em crianças à vacina polissacarídica capsular pneumocócica 23-valente (Pneumovax)

Os detalhes são descritos abaixo:

1. Local de estudo Kilifi District Hospital.
2. População do estudo e amostragem Casos e controles da coorte de nascimento de Kilifi que estão vivos no final da observação da coorte (com 24 meses de idade) e permanecem residentes no distrito de Kilifi serão vacinados com uma dose única subcutânea de 0,5 ml de 23 vacina pneumocócica polissacarídica valente (Pneumovax 23) para comparar a dinâmica da resposta de anticorpos anticapsulares a 5 antígenos capsulares escolhidos para representar diferentes perfis imunológicos dos polissacarídeos capsulares pneumocócicos (1, 6B, 14, 19F, 23F).

3. Recrutamento Os potenciais sujeitos do estudo serão identificados e suas mães serão abordadas, informadas sobre o estudo, inclusive sobre a necessidade de fazer o teste de HIV, e convidadas a participar. Um pesquisador de campo explicará a lógica e os procedimentos para o estudo e dará à mãe uma folha de informações/formulário de consentimento para levar. A mãe também receberá um recibo de consulta e uma passagem para retornar ao hospital na data marcada. As marcações serão na enfermaria 1. Quando a mãe retornar, o pesquisador de campo examinará o formulário de consentimento novamente e pedirá que a mãe assine. A mãe será aconselhada e seu filho será testado para HIV. Se o participante for positivo, a criança será encaminhada para a Kilifi Family Clinic. Se o participante for negativo, a criança receberá a dose única de Pneumovax (vacina polissacarídica 23 valente). A mãe receberá um cronograma de mais 2 consultas para exames de sangue e, em cada visita, a passagem de e para o hospital será fornecida pelo KEMRI. Os participantes do estudo que foram vacinados e posteriormente não compareceram serão visitados por FW em uma motocicleta para convidá-los a comparecer às suas consultas no dia seguinte. Serão coletadas informações sobre idade, sexo e exposições ambientais, como: número de irmãos mais velhos e mais novos na casa, exposição à fumaça de cozinha, tabagismo passivo, internação recente no hospital.

   Definição de casos:

   Casos de IPD, IRA ou pneumonia radiográfica e meningite serão definidos como episódios de doença, requerendo internação hospitalar, que ocorrem em membros da coorte entre o nascimento e a idade de 23 meses que também atendem a pelo menos uma das seguintes definições de síndrome: PNEUMOCÓCICA INVASIVA A DOENÇA é definida por um resultado positivo em QUALQUER dos seguintes critérios: (i) cultura de S. pneumoniae de qualquer local normalmente estéril, incluindo sangue, LCR, pulmão, líquido sinovial, mas excluindo fluido do ouvido médio e esfregaços oculares externos. OU (ii) Aumento de duas vezes na concentração de anticorpo anti-PsaA medido por ELISA em duas amostras de soro obtidas com pelo menos 5 dias de intervalo 21 E presença na urina de polissacarídeo capsular pneumocócico detectado por ensaio de aglutinação em látex 46. A IRA é definida por uma história aguda (<2 semanas) de tosse ou dificuldade respiratória acompanhada de aumento da frequência respiratória (≥50/min em uma criança <12 meses, ≥40/min em uma criança de 12-23 meses). A IRA é grave se houver também tiragem subcostal e muito grave se houver também cianose central e prostração ou incapacidade de beber 47.

   A PNEUMONIA RADIOGRÁFICA é definida como IRA acompanhada de consolidação radiográfica. Todas as radiografias serão avaliadas pelos médicos do estudo e por um radiologista consultor. A "consolidação radiográfica" só será considerada presente se documentada por ambos os observadores.

   MENINGITE: A meningite está sendo definida para direcionar o uso de testes diagnósticos adicionais para IPD. É necessária uma definição que seja sensível, mas não necessariamente altamente específica para meningite pneumocócica. Qualquer criança que for transferida para a unidade de alta dependência do KEMRI com diagnóstico clínico de "Meningite", qualquer criança que tenha iniciado o regime antibiótico padrão para meningite ou qualquer criança com contagem elevada de leucócitos no LCR ou proporção de glicose no LCR/plasma <0,5 será considerado como um caso de meningite para fins deste estudo.

   Um único episódio de doença pode satisfazer uma, duas, três ou todas as definições de caso. A definição de IPD é para uso no estudo de caso-controle. As outras definições são para uso no estudo da incidência e etiologia de IRA grave e pneumonia radiográfica e para orientar o fluxo de investigações de pacientes com suspeita de DPI.

4. Métodos laboratoriais ANTI-CAPSULAR IGG ELISA. O método de Quataert et al. será usado com pequenas modificações 13,14. Placas de microtitulação de fundo plano (Nunc Maxisorb, Nunc, Finlândia) são revestidas com 20 μg/ml de polissacarídeo capsular purificado (American Type Culture Collection, Manassas, Virgínia, EUA) em solução salina tamponada com fosfato 0,01 M (PBS), pH 7,2, por 5 horas a 37oC e, em seguida, armazenado a 4oC. As placas são lavadas cinco vezes com PBS, pH 7,2, com 0,05% de Tween-20 após cada estágio. Os soros de teste são diluídos 1:50 em 1% de albumina de soro bovino, 0,05% de Tween-20 em PBS contendo 10 μg/ml de polissacarídeo C (Statens Seruminstitut, Copenhague, Dinamarca) e 20 μg/ml de polissacarídeo de sorotipos 22F (American Type Culture Coleta) incubados por 30 minutos em temperatura ambiente. Os soros de teste são aliquotados na placa em duplicado em 8 diluições triplas e incubados à temperatura ambiente durante 1 hora. Um soro de referência padrão (89SF, Dr. Carl Frasch, FDA, EUA) e um controle (soro pós-vacinação de um indivíduo com boas respostas a todos os sorotipos de vacina) são testados em cada placa em sete diluições de 3 vezes. O anticorpo ligado é marcado com IgG anti-humano de cabra conjugado com fosfatase alcalina em uma incubação de 2 horas à temperatura ambiente. A enzima ligada é visualizada com fosfato de p-nitrofenil em substrato de dietanolamina (Sigma) por 2 horas à temperatura ambiente e a reação é interrompida com NaOH 3M. As placas são lidas por um leitor ELISA em um comprimento de onda de 450 nm com um filtro de referência de 620 nm. Os resultados são analisados ​​por um programa de ajuste de curva log-logística de 4 parâmetros (ELISA v1.11, Centros de Controle e Prevenção de Doenças, Atlanta, GA) e expressos em relação às concentrações conhecidas do soro de referência.

   ELISA PARA ANTI-PSAA: O método de Tharpe et al. serão usados ​​em pares ou triplicados de soros. Placas de microtitulação de fundo plano (Immunlon II HB, Dynatech Corp, Chantilly, VA) são revestidas com 2,5 μg/ml de PsaA purificada em tampão fosfato salino 0,01M (PBS), pH 7,2, por 16 horas a 4oC. PsaA é produzido por recombinação e expressão em Escherichia coli do gene que codifica PsaA. As placas são lavadas quatro vezes com PBS, pH 7,2, com 0,05% de Tween-20 após cada etapa, exceto o bloqueio, quando as placas são simplesmente esvaziadas. As placas são bloqueadas por 1 hora a 37oC com 1% de albumina de soro bovino (grau EIA, Sigma Chemical Co., St Louise, MO) 10 mg/L em PBS. Os soros de teste são diluídos em soro de albumina bovina a 1%, Tween-20 a 0,05% em PBS e incubados por 1 hora a 37oC. Os soros de teste são analisados ​​em duplicado em 8 diluições duplas e todos os soros de um paciente são analisados ​​na mesma placa. Um soro de referência de alta concentração de anti-PsaA e um controle (Sandoglobulin, Sandoz, Suíça) são testados em cada placa em sete diluições de 2 vezes. O anticorpo ligado é marcado com IgG-Fc anti-humano monoclonal de camundongo conjugado com peroxidase de rábano (clone PH6043, laboratórios Hybridoma Reagent, Baltimore, MD) em uma incubação de 2 horas a 37oC. A enzima ligada é visualizada com tetrametilbenzidina (substrato de peroxidase de micropoço de 1 componente TMB, Kirkegaard e Perry Laboratories Inc, Gaithersburg, MD) durante 30 minutos à temperatura ambiente e a reação é interrompida com ácido sulfúrico 0,18M. As placas são lidas por um leitor ELISA em um comprimento de onda de 450 nm com um filtro de referência de 620 nm. Os resultados são analisados ​​por um programa de ajuste de curva log-logística de 4 parâmetros (ELISA v1.11, Centros de Controle e Prevenção de Doenças, Atlanta, GA) e expressos em unidades ELISA como uma porcentagem da concentração do soro de referência.

5. Armazenamento de dados Os formulários de recrutamento e acompanhamento serão armazenados em um escritório de estudos trancado. As informações dos formulários serão inseridas em um computador usando o Filemaker Pro 5.5 e serão vinculadas ao número do estudo e à visita com os dados do laboratório.