儿童对 23 价肺炎球菌荚膜多糖疫苗 (Pneumovax) 的免疫反应动力学

详情如下：

1. 研究地点 Kilifi 区医院。
2. 研究人群和抽样来自 Kilifi 出生队列的病例和对照在队列观察结束时（24 个月大时）仍然活着并且仍然居住在 Kilifi 地区，将接种单次 0.5 毫升皮下剂量的 23价肺炎球菌多糖疫苗 (Pneumovax 23) 比较抗荚膜抗体对 5 种荚膜抗原的反应动力学，这些抗原被选择代表肺炎球菌荚膜多糖的不同免疫学特征（1、6B、14、19F、23F）。

3. 招募 将确定潜在的研究对象，并联系他们的母亲，告知该研究，包括接受 HIV 检测的必要性，并邀请他们参加。 现场工作人员将解释研究的基本原理和程序，并会给母亲一份信息表/同意书，让他们带走。 母亲还将获得预约单和在预约日期返回医院的车费。 预约地点为 1 号病房。 当母亲回来时，现场工作人员将再次填写同意书并要求母亲签字。 母亲将接受咨询，她的孩子将接受 HIV 检测。 如果参与者呈阳性，孩子将被转介到 Kilifi 家庭诊所。 如果参与者呈阴性，孩子将接受单剂 Pneumovax（23 价多糖疫苗）。 母亲将获得 2 次进一步预约的血液检查时间表，每次访问时，往返医院的费用将由 KEMRI 提供。 已接种疫苗但随后未参加的研究对象将由 FW 骑摩托车拜访，邀请他们在第二天继续赴约。 将收集有关年龄、性别和环境暴露的信息，例如：家中的兄弟姐妹人数、烹饪烟雾暴露、被动吸烟、近期入院情况。

   案例定义：

   IPD、ARI 或放射影像学肺炎和脑膜炎病例将被定义为需要入院治疗的疾病发作，发生在出生至 23 个月大的队列成员中，并且至少符合以下综合征定义之一：侵袭性肺炎球菌疾病定义为以下任一标准的阳性结果：(i) 从任何正常无菌部位培养肺炎链球菌，包括血液、脑脊液、肺、滑液，但不包括中耳液和外眼拭子。 或 (ii) 在间隔至少 5 天获得的两个血清样本中通过 ELISA 测量的抗 PsaA 抗体浓度增加了两倍 21 并且通过乳胶凝集试验检测到尿液中存在肺炎球菌荚膜多糖 46。 ARI 的定义是急性（<2 周）咳嗽史或呼吸困难并伴有呼吸频率加快（<12 个月的儿童≥50 次/分钟，12-23 个月的儿童≥40 次/分钟）。 如果此外还有胸部凹陷，则 ARI 很严重，如果另外还有中枢性紫绀和虚脱或无法饮水，则非常严重 47。

   影像学肺炎定义为伴有影像实变的 ARI。 研究医师和顾问放射科医师将对所有放射照片进行评级。 仅当两名观察员均有记录时，才认为存在“射线照相合并”。

   脑膜炎：脑膜炎被定义为针对 IPD 使用额外的诊断测试。 需要一个对肺炎球菌性脑膜炎敏感但不一定高度特异的定义。 任何被转移到 KEMRI 高依赖单元且临床诊断为“脑膜炎”的儿童、任何开始接受标准脑膜炎抗生素方案的儿童，或任何脑脊液白细胞计数升高或脑脊液/血浆葡萄糖比率 <0.5 的儿童都将被出于本研究的目的，将其视为脑膜炎病例。

   一次疾病发作可能满足一个、两个、三个或所有病例定义。 IPD 的定义用于病例对照研究。 其他定义用于研究严重 ARI 和放射性肺炎的发病率和病因学，并指导疑似 IPD 患者的调查流程。

4. 实验室方法抗荚膜 IGG ELISA。 Quataert 等人的方法。将在稍作修改后使用 13,14。 平底微量滴定板（Nunc Maxisorb，Nunc，芬兰）用 20 μg/ml 纯化荚膜多糖（美国典型培养物保藏中心，马纳萨斯，弗吉尼亚，美国）在 0.01M 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，pH 7.2 中包被 5 小时在 37oC 下保存，然后在 4oC 下保存。 在每个阶段后用 PBS，pH7.2 和 0.05% Tween-20 洗涤板五次。 测试血清在含有 10 μg/ml C-多糖（Statens Seruminstitut，哥本哈根，丹麦）和 20 μg/ml 血清型 22F 多糖（美国典型培养物）的 PBS 中以 1:50 稀释 1% 牛血清白蛋白、0.05% Tween-20收集）在室温下孵育 30 分钟。 将测试血清以 8 个三倍稀释度一式两份等分到板上，并在室温下孵育 1 小时。 标准参考血清（89SF，Carl Frasch 博士，FDA，美国）和对照（来自对所有疫苗血清型都有良好反应的个体的疫苗接种后血清）在每个板上以七次 3 倍稀释进行测定。 结合的抗体在室温下孵育 2 小时，用碱性磷酸酶偶联的山羊抗人 IgG 标记。 结合酶在二乙醇胺底物 (Sigma) 中用磷酸对硝基苯酯在室温下观察 2 小时，然后用 3M NaOH 终止反应。 板由 ELISA 阅读器在 450 nm 波长和 620 nm 参考滤光片下读取。 结果通过 4 参数逻辑对数曲线拟合程序（ELISA v1.11，疾病控制和预防中心，亚特兰大，乔治亚州）进行分析，并相对于参考血清的已知浓度表示。

   抗 PSAA 酶联免疫吸附试验：Tharpe 等人的方法。将用于成对或一式三份的血清。 平底微量滴定板（Immunlon II HB，Dynatech Corp，Chantilly，VA）在 4oC 下用 2.5 μg/ml 纯化的 PsaA 在 0.01M 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，pH 7.2 中包被 16 小时。 PsaA 是由编码 PsaA 的基因在大肠杆菌中重组和表达产生的。 每个阶段后用 PBS，pH7.2 和 0.05% Tween-20 洗涤板四次，除了封闭，此时板被简单地清空。 将板在 37oC 下用 1% 牛血清白蛋白（EIA 级，Sigma Chemical Co.，St Louise，MO）10mg/L 的 PBS 溶液封闭 1 小时。 测试血清在 1% 牛血清白蛋白、0.05% Tween-20 的 PBS 溶液中稀释，并在 37oC 下孵育 1 小时。 测试血清以 8 个两倍稀释度一式两份进行测定，并且来自一位患者的所有血清在同一平板上进行测定。 高抗 PsaA 浓度的参考血清和对照（Sandoglobulin, Sandoz, Switzerland）在每个平板上以 7 个 2 倍稀释度进行测定。 结合的抗体在 37oC 下孵育 2 小时，用与辣根过氧化物酶偶联的小鼠单克隆抗人 IgG-Fc（克隆 PH6043，Hybridoma Reagent laboratories，Baltimore，MD）标记。 结合酶在室温下用四甲基联苯胺（TMB 1 组分微孔过氧化物酶底物，Kirkegaard 和 Perry Laboratories Inc, Gaithersburg, MD）显现 30 分钟，然后用 0.18M 硫酸终止反应。 板由 ELISA 阅读器在 450 nm 波长和 620 nm 参考滤光片下读取。 结果通过 4 参数逻辑对数曲线拟合程序（ELISA v1.11，疾病控制和预防中心，亚特兰大，乔治亚州）进行分析，并以 ELISA 单位表示为参考血清浓度的百分比。

5. 数据存储招募和后续表格将存储在上锁的研究办公室中。 表格中的信息将使用 Filemaker Pro 5.5 输入计算机，并将链接到研究编号和访问实验室数据。