Lasten immuunivasteen dynamiikka 23-valenttiselle pneumokokkikapselipolysakkaridirokotteelle (Pneumovax)

Yksityiskohdat on kuvattu alla:

1. Opintopaikka Kilifin piirisairaala.
2. Tutkimuspopulaatio ja näytteenotto Kilifin syntymäkohortin tapaukset ja kontrollit, jotka ovat elossa kohorttihavainnon lopussa (24 kuukauden iässä) ja asuvat Kilifin alueella, rokotetaan yhdellä 0,5 ml:n ihonalaisella annoksella 23 valentti pneumokokkipolysakkaridirokote (Pneumovax 23) vertaamaan kapselivasta-ainevasteen dynamiikkaa viiteen kapseliantigeeniin, jotka on valittu edustamaan pneumokokkikapselipolysakkaridien erilaisia ​​immunologisia profiileja (1, 6B, 14, 19F, 23F).

3. Rekrytointi Mahdolliset opiskeluhenkilöt tunnistetaan ja heidän äitejään lähestytään, tiedotetaan tutkimuksesta, mukaan lukien HIV-testauksen välttämättömyydestä, ja heidät kutsutaan mukaan. Kenttätyöntekijä selittää tutkimuksen perusteet ja menettelytavat ja antaa äidille tietolomakkeen/suostumuslomakkeen mukaan otettavaksi. Äidille jaetaan myös tapaamistodistus ja lippu, jolla hän voi palata sairaalaan vastaanottopäivänä. Ajanvaraus tapahtuu osastolla 1. Kun äiti palaa, kenttätyöntekijä käy uudelleen suostumuslomakkeen läpi ja pyytää äitiä allekirjoittamaan. Äitiä neuvotaan ja hänen lapselleen tehdään HIV-testi. Jos osallistuja on positiivinen, lapsi ohjataan Kilifin perheneuvolaan. Jos osallistuja on negatiivinen, lapsi saa kerta-annoksen Pneumovaxia (23-valenttinen polysakkaridirokote). Äidille varataan 2 lisäaikataulu verikokeisiin ja jokaisella käynnillä KEMRI maksaa sairaalaan ja takaisin. FW vierailee moottoripyörällä rokotettujen ja myöhemmin osallistumattomien tutkimushenkilöiden luona ja kutsuu heidät pitämään tapaamisaikansa heti seuraavana päivänä. Tietoja kerätään iästä, sukupuolesta ja ympäristöaltistumisesta, kuten: vanhempien ja nuorempien sisarusten lukumäärä talossa, altistuminen ruoanlaittosavulle, passiivinen tupakointi, äskettäinen sairaalahoito.

   Tapausten määritelmä:

   IPD-, ARI- tai radiografinen keuhkokuume ja aivokalvontulehdus määritellään sairauskohtauksiksi, jotka edellyttävät sairaalahoitoa ja jotka esiintyvät kohortin jäsenillä syntymän ja 23 kuukauden iän välisenä aikana ja jotka täyttävät myös vähintään yhden seuraavista oireyhtymän määritelmistä: INVASIIVINEN PNEUMOKOKKI SAIRAUS määritellään positiivisella tuloksella JOKAMPAN seuraavista kriteereistä: (i) S. pneumoniae -viljelmä mistä tahansa normaalisti steriilistä paikasta, mukaan lukien veri, aivo-selkäydinneste, keuhkot, nivelneste, mutta ei välikorvan nestettä ja ulkoisen silmän vanupuikkoja. TAI (ii) Kaksinkertainen nousu anti-PsaA-vasta-ainepitoisuudessa ELISA:lla mitattuna kahdesta seeruminäytteestä, jotka on otettu vähintään 5 päivän välein 21 JA pneumokokkikapselipolysakkaridin esiintyminen virtsassa lateksiagglutinaatiomäärityksellä 46. ARI määritellään akuutin (< 2 viikkoa) yskän tai hengitysvaikeuden anamneesilla, johon liittyy kohonnut hengitystiheys (≥ 50/min lapsella < 12 kuukautta, ≥ 40/min lapsella 12-23 kuukauden ikäisillä). ARI on vakava, jos lisäksi rintakehä vetää sisään, ja erittäin vakava, jos sen lisäksi esiintyy sentraalista syanoosia ja uupumusta tai kyvyttömyys juoda 47.

   RADIOGRAAFINEN PNEUMONIA määritellään ARI:ksi, johon liittyy röntgenkuvaus. Kaikki röntgenkuvat arvioivat sekä tutkimuslääkärit että konsulttiradiologi. "Radiografisen konsolidoinnin" katsotaan olevan olemassa vain, jos molemmat tarkkailijat ovat dokumentoineet sen.

   Aivokalvontulehdus: Aivokalvontulehdus määritellään kohdistamaan IPD:n diagnostisten lisätestien käyttöön. Tarvitaan määritelmä, joka on herkkä mutta ei välttämättä kovin spesifinen pneumokokki-aivokalvontulehdukselle. Kaikki lapset, jotka siirretään KEMRI:n korkean riippuvuuden yksikköön, jolla on kliininen diagnoosi "aivokalvontulehdus", kaikki lapset, jotka ovat aloittaneet normaalin aivokalvontulehduksen antibioottihoidon, tai lapset, joilla on kohonnut CSF:n leukosyyttien määrä tai CSF/plasman glukoosisuhde <0,5 pidetään aivokalvontulehduksena tässä tutkimuksessa.

   Yksi sairauskohtaus voi täyttää yhden, kaksi, kolme tai kaikki tapausmääritelmät. IPD:n määritelmä on tarkoitettu tapaus-verrokkitutkimukseen. Muut määritelmät on tarkoitettu käytettäväksi vaikean ARI:n ja radiografisen keuhkokuumeen esiintyvyyden ja etiologian tutkimuksessa sekä ohjaamaan IPD-epäiltyjen potilaiden tutkimuskulkua.

4. Laboratoriomenetelmät ANTIKAPSULAARINEN IGG ELISA. Quataertin et ai. käytetään pienin muutoksin 13,14. Tasapohjaiset mikrotiitterilevyt (Nunc Maxisorb, Nunc, Suomi) päällystetään 20 μg/ml puhdistetulla kapselipolysakkaridilla (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA) 0,01 M fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), pH 7,2, 5 tunnin ajan. 37 oC:ssa ja säilytetään sitten 4 oC:ssa. Levyt pestään viisi kertaa PBS:llä, pH 7,2, 0,05 % Tween-20:lla kunkin vaiheen jälkeen. Testiseerumit laimennetaan 1:50 1 % naudan seerumin albumiiniin, 0,05 % Tween-20:een PBS:ssä, joka sisältää 10 μg/ml C-polysakkaridia (Statens Seruminstitut, Kööpenhamina, Tanska) ja 20 μg/ml polysakkaridia serotyyppien 2 tyypin F (American 2 tyypin F) kanssa. Keräys) inkuboitiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Testiseerumit jaetaan levylle kahtena rinnakkaisena 8 kolminkertaisena laimennoksena ja inkuboidaan huoneenlämpötilassa 1 tunti. Standardivertailuseerumi (89SF, Dr Carl Frasch, FDA, USA) ja kontrolli (rokotuksen jälkeinen seerumi yksilöltä, jolla on hyvä vaste kaikille rokotteen serotyypeille) määritetään jokaiselle levylle seitsemässä kolminkertaisessa laimennoksessa. Sitoutunut vasta-aine leimataan alkalisella fosfataasilla konjugoidulla vuohen anti-ihmis-IgG:llä 2 tunnin inkubaatiossa huoneenlämpötilassa. Sitoutunut entsyymi visualisoidaan p-nitrofenyylifosfaatilla dietanoliamiinisubstraatissa (Sigma) 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja reaktio pysäytetään 3 M NaOH:lla. Levyt luetaan ELISA-lukijalla aallonpituudella 450 nm 620 nm:n vertailusuodattimella. Tulokset analysoidaan 4-parametrin logistisen logaritmiskäyrän sovitusohjelmalla (ELISA v1.11, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA) ja ilmaistaan ​​suhteessa tunnettuihin vertailuseerumin pitoisuuksiin.

   ELISA ANTI-PSAA:lle: Tharpen et ai. käytetään seerumin pareihin tai kolminkertaisiin sarjoihin. Tasapohjaiset mikrotiitterilevyt (Immunlon II HB, Dynatech Corp, Chantilly, VA) päällystetään 2,5 μg/ml puhdistetulla PsaA:lla 0,01 M fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), pH 7,2, 16 tunnin ajan 4 °C:ssa. PsaA tuotetaan PsaA:ta koodaavan geenin rekombinaatiolla ja ekspressiolla Escherichia colissa. Levyt pestään neljä kertaa PBS:llä, pH 7,2, 0,05 % Tween-20:lla jokaisen vaiheen jälkeen lukuun ottamatta blokkausta, jolloin levyt yksinkertaisesti tyhjennetään. Levyt estetään 1 tunnin ajan 37 °C:ssa 1 % naudan seerumialbumiinilla (EIA Grade, Sigma Chemical Co., St Louise, MO) 10 mg/l PBS:ssä. Testiseerumit laimennetaan 1 % naudan seerumin albumiiniin, 0,05 % Tween-20:een PBS:ssä ja inkuboidaan 1 tunti 37 °C:ssa. Testiseerumit määritetään kahtena rinnakkaisena 8 kaksinkertaisessa laimennoksessa ja kaikki yhdeltä potilaalta peräisin olevat seerumit määritetään samalla levyllä. Vertailuseerumi, jossa on korkea anti-PsaA-pitoisuus, ja kontrolli (Sandoglobulin, Sandoz, Sveitsi) määritetään jokaiselle levylle seitsemässä 2-kertaisessa laimennoksessa. Sitoutunut vasta-aine leimataan hiiren monoklonaalisella anti-ihmisen IgG-Fc:llä, joka on konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (klooni PH6043, Hybridoma Reagent laboratories, Baltimore, MD) 2 tunnin inkubaatiossa 37 °C:ssa. Sitoutunut entsyymi visualisoidaan tetrametyylibentsidiinillä (TMB 1-komponenttinen mikrokuoppaperoksidaasisubstraatti, Kirkegaard and Perry Laboratories Inc, Gaithersburg, MD) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja reaktio pysäytetään 0,18 M rikkihapolla. Levyt luetaan ELISA-lukijalla aallonpituudella 450 nm 620 nm:n vertailusuodattimella. Tulokset analysoidaan 4-parametrin logistiikka-logikäyrän sovitusohjelmalla (ELISA v1.11, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA) ja ilmaistaan ​​ELISA-yksiköinä prosentteina vertailuseerumin pitoisuudesta.

5. Tietojen säilytys Rekrytointi- ja seurantalomakkeita säilytetään lukitussa opintotoimistossa. Lomakkeiden tiedot syötetään tietokoneelle Filemaker Pro 5.5:llä ja linkitetään tutkimusnumeroon ja käyntiin laboratoriotietojen kanssa.