Dynamika imunitní odpovědi u dětí na 23valentní pneumokokovou kapsulární polysacharidovou vakcínu (Pneumovax)

Podrobnosti jsou popsány níže:

1. Studijní místo Kilifi District Hospital.
2. Studijní populace a odběr vzorků Případy a kontroly z kohorty Kilifi narození, které jsou na konci kohortového pozorování naživu (ve věku 24 měsíců) a zůstávají rezidenty v Kilifi District, budou očkovány jednou 0,5 ml subkutánní dávkou 23 valentní pneumokokové polysacharidové vakcíny (Pneumovax 23) k porovnání dynamiky antikapsulární protilátkové odpovědi na 5 kapsulárních antigenů vybraných tak, aby reprezentovaly různé imunologické profily pneumokokových kapsulárních polysacharidů (1, 6B, 14, 19F, 23F).

3. Nábor Budou identifikovány potenciální subjekty studie a budou osloveny jejich matky, informovány o studii, včetně nutnosti podstoupit HIV testování, a pozvány k účasti. Terénní pracovník vysvětlí důvody a postupy studie a dá matce informační list/formulář souhlasu, který si může odnést. Matka také obdrží schůzku a jízdné pro návrat do nemocnice v den schůzky. Schůzky budou na oddělení 1. Když se matka vrátí, terénní pracovník znovu projde formulář souhlasu a požádá matku, aby podepsala. Matce bude poskytnuto poradenství a její dítě bude testováno na HIV. Pokud bude účastník pozitivní, bude dítě odesláno do Kilifi Family Clinic. Pokud je účastník negativní, dítě dostane jednorázovou dávku Pneumovaxu (23valentní polysacharidová vakcína). Matce bude poskytnut rozpis dalších 2 schůzek na krevní testy a při každé návštěvě bude jízdné do nemocnice a zpět poskytnuto společností KEMRI. Studijní subjekty, které byly očkovány a následně se nezúčastní, navštíví FW na motocyklu, aby je pozval, aby dodrželi termín hned následující den. Budou shromažďovány informace týkající se věku, pohlaví a expozice životního prostředí, jako jsou: počet starších a mladších sourozenců v domě, expozice kouře z vaření, pasivní kouření cigaret, nedávné přijetí do nemocnice.

   Definice případů:

   Případy IPD, ARI nebo rentgenové pneumonie a meningitidy budou definovány jako epizody onemocnění vyžadující přijetí do nemocnice, které se vyskytují u členů kohorty mezi narozením a věkem 23 měsíců, které rovněž splňují alespoň jednu z následujících definic syndromu: INVAZIVNÍ PNEUMOKOKÁLNÍ ONEMOCNĚNÍ je definováno pozitivním výsledkem BUDEHO z následujících kritérií: (i) kultivace S. pneumoniae z jakéhokoli normálně sterilního místa včetně krve, mozkomíšního moku, plic, synoviální tekutiny, ale s výjimkou tekutiny ze středního ucha a výtěrů z vnějšího oka. NEBO (ii) Dvojnásobné zvýšení koncentrace anti-PsaA protilátky měřené metodou ELISA ve dvou vzorcích séra získaných s odstupem alespoň 5 dnů 21 A přítomnost pneumokokového kapsulárního polysacharidu v moči detekovaného latexovou aglutinační zkouškou 46. ARI je definována akutní (<2 týdny) anamnézou kašle nebo potíží s dýcháním doprovázených zvýšenou dechovou frekvencí (≥50/min u dítěte <12 měsíců, ≥40/min u dítěte 12-23 měsíců). ARI je závažná, pokud je navíc přítomno stažení hrudníku, a velmi závažná, je-li navíc přítomna centrální cyanóza a prostrace nebo neschopnost pít 47.

   RADIOGRAFICKÁ PNEUMONIE je definována jako ARI doprovázená rentgenovou konsolidací. Všechny rentgenové snímky budou hodnoceny jak studujícími lékaři, tak radiologickým konzultantem. "Radiografická konsolidace" bude považována za přítomnou pouze tehdy, bude-li zdokumentována oběma pozorovateli.

   MENINGITIDA: Meningitida je definována tak, aby se zaměřovala na použití dalších diagnostických testů pro IPD. Je vyžadována definice, která je citlivá, ale ne nutně vysoce specifická pro pneumokokovou meningitidu. Každé dítě, které bude převezeno na jednotku KEMRI s vysokou závislostí s klinickou diagnózou „meningitida“, každé dítě, které začalo se standardním režimem antibiotik proti meningitidě, nebo každé dítě se zvýšeným počtem leukocytů v CSF nebo poměrem CSF/glukóza v plazmě <0,5 bude pro účely této studie považováno za případ meningitidy.

   Jedna epizoda nemoci může splňovat jednu, dvě, tři nebo všechny definice případů. Definice IPD je pro použití v případové a kontrolní studii. Ostatní definice jsou pro použití při studiu incidence a etiologie těžké ARI a radiografické pneumonie a pro vedení toku vyšetřování pacientů s podezřením na IPD.

4. Laboratorní metody ANTI-KAPULÁRNÍ IGG ELISA. Metoda Quataerta a kol. bude s drobnými úpravami použit 13,14. Mikrotitrační destičky s plochým dnem (Nunc Maxisorb, Nunc, Finsko) jsou potaženy 20 μg/ml purifikovaného kapsulárního polysacharidu (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA) v 0,01 M fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS), pH 7,2, po dobu 5 hodin při 37oC a poté skladovány při 4oC. Destičky se po každé fázi pětkrát promyjí PBS, pH 7,2, s 0,05% Tween-20. Testovaná séra se ředí 1:50 v 1% hovězím sérovém albuminu, 0,05% Tween-20 v PBS obsahujícím 10 μg/ml C-polysacharidu (Statens Seruminstitut, Kodaň, Dánsko) a 20 μg/ml polysacharidu sérotypů 22F (American Type Culture odběr) inkubován po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Testovací séra se alikvotně nanesou na destičku v duplikátech v 8 trojnásobných ředěních a inkubují se při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Standardní referenční sérum (89SF, Dr. Carl Frasch, FDA, USA) a kontrolní (postvakcinační sérum od jedince s dobrou odpovědí na všechny sérotypy vakcíny) se testují na každé destičce v sedmi 3násobných ředěních. Navázaná protilátka je značena kozím anti-lidským IgG konjugovaným s alkalickou fosfatázou při 2hodinové inkubaci při pokojové teplotě. Navázaný enzym se vizualizuje p-nitrofenylfosfátem v diethanolaminovém substrátu (Sigma) po dobu 2 hodin při teplotě místnosti a reakce se zastaví 3M NaOH. Destičky se odečítají čtečkou ELISA při vlnové délce 450 nm s referenčním filtrem 620 nm. Výsledky jsou analyzovány 4parametrovým logistickým logaritmickým programem pro proložení křivky (ELISA v1.11, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA) a vyjádřeny ve vztahu ke známým koncentracím referenčního séra.

   ELISA PRO ANTI-PSAA: Metoda Tharpeho et al. budou použity na párech nebo trojicích sér. Mikrotitrační destičky s plochým dnem (Immunlon II HB, Dynatech Corp, Chantilly, VA) jsou potaženy 2,5 ug/ml purifikovaného PsaA v 0,01 M fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS), pH 7,2, po dobu 16 hodin při 4 °C. PsaA je produkován rekombinací a expresí v Escherichia coli genu kódujícího PsaA. Destičky se promyjí čtyřikrát PBS, pH 7,2, s 0,05% Tween-20 po každém stupni kromě blokování, kdy se plotny jednoduše vyprázdní. Destičky se blokují 1 hodinu při 37 °C 1% hovězím sérovým albuminem (EIA Grade, Sigma Chemical Co., St Louise, MO) 10 mg/l v PBS. Testovaná séra se zředí v 1% hovězím sérovém albuminu, 0,05% Tween-20 v PBS a inkubují se 1 hodinu při 37 °C. Testovaná séra se testují v duplikátech v 8 dvojnásobných ředěních a všechna séra od jednoho pacienta se testují na stejné destičce. Referenční sérum s vysokou koncentrací anti-PsaA a kontrola (Sandoglobulin, Sandoz, Švýcarsko) se testují na každé destičce v sedmi dvojnásobných ředěních. Navázaná protilátka je značena myší monoklonální anti-lidskou IgG-Fc konjugovanou s křenovou peroxidázou (klon PH6043, Hybridoma Reagent laboratories, Baltimore, MD) při 2hodinové inkubaci při 37 °C. Vázaný enzym se vizualizuje tetramethylbenzidinem (TMB 1-komponentní mikrojamkový peroxidázový substrát, Kirkegaard and Perry Laboratories Inc, Gaithersburg, MD) po dobu 30 minut při teplotě místnosti a reakce se zastaví 0,18M kyselinou sírovou. Destičky se odečítají čtečkou ELISA při vlnové délce 450 nm s referenčním filtrem 620 nm. Výsledky jsou analyzovány 4parametrovým logistickým logaritmickým programem pro proložení křivky (ELISA v1.11, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA) a vyjádřeny v jednotkách ELISA jako procento koncentrace referenčního séra.

5. Úložiště dat Náborové a navazující formuláře budou uloženy v uzamčené studijní kanceláři. Informace z formulářů budou vloženy do počítače pomocí Filemaker Pro 5.5 a budou spojeny s číslem studie a návštěvou s laboratorními daty.