Gyermekek immunválaszának dinamikája a 23-valens pneumococcus kapszuláris poliszacharid vakcinára (Pneumovax)

A részletek a következők:

1. Tanulmányi helyszín Kilifi Körzeti Kórház.
2. Vizsgálati populáció és mintavétel A Kilifi születési kohorszból származó eseteket és kontrollokat, akik a kohorsz megfigyelés végén (24 hónapos korukban) élnek és továbbra is Kilifi körzetben élnek, egyetlen 0,5 ml-es 23 éves szubkután adaggal oltják be. vegyértékű pneumococcus poliszacharid vakcina (Pneumovax 23), hogy összehasonlítsa az anti-kapszuláris antitest válasz dinamikáját 5 olyan kapszuláris antigénnel, amelyek a pneumococcus tokpoliszacharidok különböző immunológiai profilját képviselik (1, 6B, 14, 19F, 23F).

3. Toborzás A potenciális vizsgálati alanyokat megkeresik, édesanyjukat megkeresik, tájékoztatják a vizsgálatról, beleértve a HIV-szűrés szükségességét, és felkérik a részvételre. Egy terepmunkás elmagyarázza a vizsgálat indokait és eljárásait, és átad az anyának egy tájékoztató lapot/beleegyezési űrlapot, hogy vigye el. Az anya kap egy időpontot, és egy viteldíjat is, hogy a találkozó napján visszatérhessen a kórházba. Az időpontok az 1. osztályon lesznek. Amikor az anya visszatér, a terepmunkás újra átnézi a beleegyezési űrlapot, és megkéri az anyát, hogy írja alá. Az anyát tanácsot adnak, gyermekét pedig HIV-tesztre vetik. Ha a résztvevő pozitív, a gyermeket a Kilifi Családi Klinikára utalják. Ha a résztvevő negatív, a gyermek egyszeri adag Pneumovaxot (23 valens poliszacharid vakcinát) kap. Az anya további 2 vérvételi időpontot kap, és minden vizit alkalmával a KEMRI biztosítja a kórházba és onnan hazautazás díját. Azokat a vizsgálati alanyokat, akiket beoltottak, és később nem vesznek részt, az FW meglátogatja motorkerékpáron, hogy felkérje őket, hogy tartsák meg a másnapi időpontjukat. Információkat gyűjtenek az életkorra, a nemre és a környezeti expozíciókra vonatkozóan, például: a házban tartózkodó idősebb és fiatalabb testvérek száma, főzési füst, passzív dohányzás, közelmúltbeli kórházi felvétel.

   Az esetek meghatározása:

   Az IPD, ARI vagy radiográfiás tüdőgyulladás és agyhártyagyulladás esetei olyan, kórházi felvételt igénylő betegségepizódoknak minősülnek, amelyek születés és 23 hónapos koruk között jelentkeznek a kohorsz tagjainál, és megfelelnek az alábbi szindrómadefiníciók legalább egyikének: INVAZÍV PNEUMOKOKKUSZ. A BETEGSÉG meghatározása a következő kritériumok EGYIKE pozitív eredményével történik: (i) S. pneumoniae tenyésztése bármely normálisan steril helyről, beleértve a vért, a CSF-et, a tüdőt, az ízületi folyadékot, de a középfülfolyadék és a külső szemtamponok kivételével. VAGY (ii) Az anti-PsaA antitest-koncentráció kétszeres emelkedése ELISA-val mérve két szérummintában, amelyeket legalább 5 nap különbséggel vettek 21 ÉS a latex agglutinációs vizsgálattal kimutatott pneumococcus kapszuláris poliszacharid jelenléte a vizeletben 46. Az ARI-t az akut (<2 hét) anamnézisben szereplő köhögés vagy légzési nehézség, amelyet megnövekedett légzésszám kísér (≥50/perc 12 hónaposnál fiatalabb gyermekeknél, ≥40/perc 12-23 hónapos gyermekeknél). Az ARI súlyos, ha mellkasi behúzás is jelentkezik, és nagyon súlyos, ha ezen kívül centrális cianózis és elmerültség vagy ivásképtelenség is jelentkezik 47.

   A RADIOGRAPHIC PNEUMÓNIÁK definíciója szerint az ARI, amelyet radiográfiás konszolidáció kísér. Minden röntgenfelvételt a vizsgálati orvosok és egy radiológus szaktanácsadó értékel. "Radiográfiás konszolidáció" csak akkor tekinthető jelen lévőnek, ha mindkét megfigyelő dokumentálja.

   MENINGITIS: Az agyhártyagyulladást úgy határozzák meg, hogy az IPD további diagnosztikai tesztjeit célozza meg. Olyan definícióra van szükség, amely érzékeny, de nem feltétlenül nagyon specifikus a pneumococcus okozta agyhártyagyulladásra. Minden olyan gyermeket, akit „Agyhártyagyulladás” klinikai diagnózisával a KEMRI nagy függőségi osztályára helyeznek át, a standard meningitis antibiotikum kezelésben részesült gyermeket, vagy bármely olyan gyermeket, akinek a CSF-ben megnövekedett leukocitaszáma vagy 0,5 alatti CSF/plazma glükóz aránya van. e tanulmány szempontjából agyhártyagyulladásnak tekinthető.

   Egyetlen betegségepizód megfelel egy, kettő, három vagy az összes esetdefiníciónak. Az IPD meghatározása az eset-kontroll vizsgálatban használatos. A többi meghatározás a súlyos ARI és a radiográfiás tüdőgyulladás előfordulásának és etiológiájának vizsgálatára szolgál, valamint az IPD-gyanús betegek kivizsgálási folyamatának irányítására.

4. Laboratóriumi módszerek ANTI-KAPSZULÁRIS IGG ELISA. Quataert et al. kisebb módosításokkal kerül felhasználásra 13,14. A lapos fenekű mikrotitráló lemezeket (Nunc Maxisorb, Nunc, Finnország) 20 μg/ml-es tisztított kapszuláris poliszachariddal (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA) vonják be 0,01 M foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS), pH 7,2, 5 órán keresztül. 37oC-on, majd 4oC-on tároljuk. A lemezeket ötször mossuk 0,05% Tween-20-at tartalmazó PBS-sel (pH 7,2). A tesztszérumokat 1:50 arányban hígítjuk 1% szarvasmarha szérumalbuminnal, 0,05% Tween-20-zal 10 μg/ml C-poliszacharidot (Statens Seruminstitut, Koppenhága, Dánia) és 20 μg/ml poliszacharidot (American 22 Type F szerotípusú kultúra) tartalmazó PBS-ben. Gyűjtemény) 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. A tesztszérumokat a lemezre aliquot részekre osztjuk, két párhuzamosban 8 háromszoros hígításban, és szobahőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk. Egy standard referenciaszérumot (89SF, Dr. Carl Frasch, FDA, USA) és egy kontrollt (az összes vakcina szerotípusra jó választ adó egyéntől származó vakcinázás utáni szérum) minden lemezen hét, háromszoros hígításban vizsgálnak. A megkötött antitestet lúgos foszfatázzal konjugált kecske anti-humán IgG-vel jelöljük 2 órás, szobahőmérsékleten végzett inkubálás során. A megkötött enzimet p-nitro-fenil-foszfáttal dietanol-amin szubsztrátban (Sigma) 2 órán át szobahőmérsékleten tettük láthatóvá, majd a reakciót 3 M NaOH-val leállítottuk. A lemezeket ELISA olvasóval olvassuk le 450 nm-es hullámhosszon, 620 nm-es referenciaszűrővel. Az eredményeket egy 4 paraméteres logisztikai log görbe illesztési programmal (ELISA v1.11, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA) elemzik, és a referenciaszérum ismert koncentrációihoz viszonyítva fejezik ki.

   ELISA AZ ANTI-PSAA-hoz: Tharpe et al. szérum páron vagy három példányon használható. A lapos fenekű mikrotitráló lemezeket (Immunlon II HB, Dynatech Corp, Chantilly, VA) 2,5 μg/ml tisztított PsaA-val vonjuk be 0,01 M foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS), pH 7,2, 16 órán át 4 °C-on. A PsaA a PsaA-t kódoló gén Escherichia coliban történő rekombinációjával és expressziójával képződik. A lemezeket négyszer mossuk PBS-sel (pH 7,2, 0,05% Tween-20-zal) minden lépés után, kivéve a blokkolást, amikor a lemezeket egyszerűen kiürítjük. A lemezeket 1 órán át 37 °C-on blokkoljuk 1% szarvasmarha-szérumalbuminnal (EIA Grade, Sigma Chemical Co., St Louise, MO) 10 mg/l PBS-ben. A tesztszérumokat 1% szarvasmarha-szérumalbuminnal, 0,05% Tween-20-zal PBS-ben hígítjuk, és 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A tesztszérumokat két párhuzamosban, 8 kétszeres hígításban vizsgáljuk, és egy pácienstől származó összes szérumot ugyanazon a lemezen vizsgáljuk. A magas anti-PsaA koncentrációjú referenciaszérumot és a kontrollt (Sandoglobulin, Sandoz, Svájc) minden lemezen hét, kétszeres hígításban vizsgálják. A megkötött antitestet torma-peroxidázhoz konjugált egér monoklonális anti-humán IgG-Fc-vel (PH6043 klón, Hybridoma Reagent laboratories, Baltimore, MD) jelöljük 2 órás, 37 oC-os inkubációval. A megkötött enzimet tetrametil-benzidinnel (TMB 1-komponensű mikrolyuk peroxidáz szubsztrát, Kirkegaard and Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD) 30 percig szobahőmérsékleten tettük láthatóvá, és a reakciót 0,18 M kénsavval leállítottuk. A lemezeket ELISA olvasóval olvassuk le 450 nm-es hullámhosszon, 620 nm-es referenciaszűrővel. Az eredményeket 4 paraméteres logisztikai-log görbe illesztési programmal (ELISA v1.11, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA) elemzik, és ELISA-egységekben fejezik ki a referenciaszérum koncentrációjának százalékában.

5. Adattárolás A felvételi és nyomon követési lapokat egy zárt tanulmányi irodában tároljuk. Az űrlapok információi a Filemaker Pro 5.5 használatával számítógépre kerülnek, és a vizsgálati számon és a látogatáson összekapcsolódnak a laboratóriumi adatokkal.