Dynamika odpowiedzi immunologicznej dzieci na 23-walentną otoczkową szczepionkę polisacharydową przeciw pneumokokom (Pneumovax)

Szczegóły są opisane poniżej:

1. Miejsce badań Szpital rejonowy Kilifi.
2. Badana populacja i pobieranie próbek Przypadki i grupy kontrolne z kohorty urodzeniowej Kilifi, które żyją pod koniec obserwacji kohorty (w wieku 24 miesięcy) i pozostają mieszkańcami dystryktu Kilifi, zostaną zaszczepione pojedynczą podskórną dawką 0,5 ml 23 walentną polisacharydową szczepionkę przeciwko pneumokokom (Pneumovax 23) w celu porównania dynamiki odpowiedzi przeciwciał przeciwotoczkowych na 5 antygenów otoczkowych wybranych do reprezentowania różnych profili immunologicznych polisacharydów otoczkowych pneumokoków (1, 6B, 14, 19F, 23F).

3. Rekrutacja Potencjalne osoby badane zostaną zidentyfikowane, a ich matki zostaną poinformowane o badaniu, w tym o konieczności poddania się testowi na obecność wirusa HIV i zaproszone do udziału. Pracownik terenowy wyjaśni przyczyny i procedury badania oraz przekaże matce kartę informacyjną/formularz zgody do zabrania. Matka otrzyma również kartę wizyty i opłatę za powrót do szpitala w dniu wizyty. Wizyty będą odbywać się na oddziale 1. Kiedy matka wróci, pracownik terenowy ponownie przejrzy formularz zgody i poprosi matkę o podpisanie. Matka otrzyma poradę, a jej dziecko zostanie poddane testowi na obecność wirusa HIV. W przypadku pozytywnego wyniku badania dziecko zostanie skierowane do Poradni Rodzinnej Kilifi. Jeśli wynik testu będzie negatywny, dziecko otrzyma pojedynczą dawkę szczepionki Pneumovax (23-walentna szczepionka polisacharydowa). Matka otrzyma harmonogram 2 kolejnych wizyt na badania krwi, a przy każdej wizycie opłata za przejazd do i ze szpitala zostanie zapewniona przez KEMRI. Osoby badane, które zostały zaszczepione, a następnie nie uczęszczają, będą odwiedzane przez FW na motocyklu, aby zaprosić ich na umówione spotkania już następnego dnia. Zostaną zebrane informacje dotyczące wieku, płci i narażenia środowiskowego, takie jak: liczba starszego i młodszego rodzeństwa w domu, narażenie na dym kuchenny, bierne palenie papierosów, niedawny pobyt w szpitalu.

   Definicja przypadków:

   Przypadki IChP, ARI lub radiologicznego zapalenia płuc i zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych będą definiowane jako epizody chorobowe wymagające przyjęcia do szpitala, które występują u członków kohorty między urodzeniem a 23 miesiącem życia, które również spełniają co najmniej jedną z następujących definicji zespołu: INWAZYJNY PNEUMOKOKOWY CHOROBA jest definiowana jako pozytywny wynik na KAŻDYM z następujących kryteriów: (i) posiew S. pneumoniae z dowolnego normalnie sterylnego miejsca, w tym krwi, płynu mózgowo-rdzeniowego, płuc, płynu maziowego, ale z wyłączeniem płynu z ucha środkowego i wymazów z zewnętrznych oczu. LUB (ii) Dwukrotny wzrost stężenia przeciwciał anty-PsaA mierzony metodą ELISA w dwóch próbkach surowicy pobranych w odstępie co najmniej 5 dni 21 ORAZ obecność pneumokokowego polisacharydu otoczkowego w moczu wykryta testem aglutynacji lateksowej 46. ARI definiuje się jako ostry (<2 tygodni) kaszel lub trudności w oddychaniu w wywiadzie, któremu towarzyszy przyspieszona częstość oddechów (≥50/min u dziecka w wieku <12 miesięcy, ≥40/min u dziecka w wieku 12-23 miesięcy). ARI jest ciężki, jeśli dodatkowo występuje wciągnięcie klatki piersiowej, i bardzo ciężki, jeśli dodatkowo występuje centralna sinica i prostracja lub niezdolność do picia 47.

   RADIOGRAFICZNE ZAPALENIE PNEUMONICZNE definiuje się jako ARI z towarzyszącą konsolidacją radiologiczną. Wszystkie zdjęcia rentgenowskie zostaną ocenione zarówno przez lekarzy prowadzących badanie, jak i przez konsultanta radiologa. „Konsolidacja radiograficzna” zostanie uznana za obecną tylko wtedy, gdy zostanie udokumentowana przez obu obserwatorów.

   ZAPALENIE MENINGOLOGICZNE: definiuje się zapalenie opon mózgowych w celu ukierunkowania na zastosowanie dodatkowych testów diagnostycznych w kierunku IChP. Konieczna jest definicja, która jest czuła, ale niekoniecznie wysoce specyficzna dla pneumokokowego zapalenia opon mózgowych. Każde dziecko przeniesione na oddział intensywnej opieki KEMRI z klinicznym rozpoznaniem „zapalenia opon mózgowych”, każde dziecko, które rozpoczęło standardową kurację antybiotykową przeciw zapaleniu opon mózgowych lub każde dziecko z podwyższoną liczbą leukocytów w płynie mózgowo-rdzeniowym lub stosunkiem glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym do stężenia glukozy w osoczu <0,5, zostanie uznano za przypadek zapalenia opon mózgowych dla celów tego badania.

   Pojedynczy epizod choroby może spełniać jedną, dwie, trzy lub wszystkie definicje przypadku. Definicja IChP ma zastosowanie w badaniu kliniczno-kontrolnym. Pozostałe definicje służą do badania częstości występowania i etiologii ciężkiego ARI i radiologicznego zapalenia płuc oraz do kierowania przebiegiem badań pacjentów z podejrzeniem IChP.

4. Metody laboratoryjne ANTI-CAPSULAR IGG ELISA. Metoda Quataerta i in. będzie używany z niewielkimi modyfikacjami 13,14. Płytki do mikromiareczkowania z płaskim dnem (Nunc Maxisorb, Nunc, Finlandia) powleka się 20 μg/ml oczyszczonego polisacharydu otoczkowego (kolekcja American Type Culture, Manassas, Wirginia, USA) w 0,01 M roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS), pH 7,2, przez 5 godzin w 37oC, a następnie przechowywano w 4oC. Płytki przemywa się pięć razy PBS, pH 7,2, z 0,05% Tween-20 po każdym etapie. Surowice testowe rozcieńcza się 1:50 w 1% albuminie surowicy bydlęcej, 0,05% Tween-20 w PBS zawierającym 10 μg/ml C-polisacharydu (Statens Seruminstitut, Kopenhaga, Dania) i 20 μg/ml polisacharydu serotypów 22F (American Type Culture Kolekcja) inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Surowice testowe nanosi się na płytkę w dwóch powtórzeniach w 8 trzykrotnych rozcieńczeniach i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Standardową surowicę referencyjną (89SF, Dr Carl Frasch, FDA, USA) i kontrolę (surowicę po szczepieniu od osobnika z dobrą odpowiedzią na wszystkie serotypy szczepionkowe) testuje się na każdej płytce w siedmiu 3-krotnych rozcieńczeniach. Związane przeciwciało znakuje się kozią anty-ludzką IgG skoniugowaną z alkaliczną fosfatazą w 2-godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej. Związany enzym wizualizuje się za pomocą fosforanu p-nitrofenylu w substracie z dietanoloaminy (Sigma) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i reakcję zatrzymuje się za pomocą 3M NaOH. Płytki są odczytywane przez czytnik ELISA przy długości fali 450 nm z filtrem odniesienia 620 nm. Wyniki analizuje się za pomocą programu dopasowywania 4-parametrowej logistyczno-logarytmicznej krzywej (ELISA v1.11, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA) i wyraża w odniesieniu do znanych stężeń surowicy odniesienia.

   ELISA NA ANTY-PSAA: Metoda Tharpe i in. będzie używany na parach lub trzech powtórzeniach surowic. Płytki do mikromiareczkowania z płaskim dnem (Immunlon II HB, Dynatech Corp, Chantilly, VA) powleka się 2,5 μg/ml oczyszczonego PsaA w 0,01 M roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS), pH 7,2, przez 16 godzin w 4oC. PsaA jest wytwarzany przez rekombinację i ekspresję w Escherichia coli genu kodującego PsaA. Płytki przemywa się czterokrotnie PBS, pH 7,2, z 0,05% Tween-20 po każdym etapie z wyjątkiem blokowania, kiedy płytki są po prostu opróżniane. Płytki blokuje się przez 1 godzinę w 37oC 1% albuminą surowicy bydlęcej (klasa EIA, Sigma Chemical Co., St Louise, MO) 10 mg/lw PBS. Surowice testowe rozcieńcza się w 1% albuminie surowicy bydlęcej, 0,05% Tween-20 w PBS i inkubuje przez 1 godzinę w temperaturze 37oC. Surowice testowe analizuje się w dwóch powtórzeniach w 8 podwójnych rozcieńczeniach i wszystkie surowice od jednego pacjenta analizuje się na tej samej płytce. Surowicę referencyjną o wysokim stężeniu anty-PsaA i kontrolę (Sandoglobulin, Sandoz, Szwajcaria) oznacza się na każdej płytce w siedmiu 2-krotnych rozcieńczeniach. Związane przeciwciało jest znakowane mysią monoklonalną anty-ludzką IgG-Fc skoniugowaną z peroksydazą chrzanową (klon PH6043, Hybridoma Reagent laboratoriów, Baltimore, MD) w 2-godzinnej inkubacji w temperaturze 37oC. Związany enzym wizualizuje się za pomocą tetrametylobenzydyny (TMB 1-składnikowy substrat peroksydazy do mikrostudzienek, Kirkegaard and Perry Laboratories Inc, Gaithersburg, MD) przez 30 minut w temperaturze pokojowej i reakcję zatrzymuje się za pomocą 0,18 M kwasu siarkowego. Płytki są odczytywane przez czytnik ELISA przy długości fali 450 nm z filtrem odniesienia 620 nm. Wyniki analizuje się za pomocą programu dopasowywania 4-parametrowej logistyczno-logarytmicznej krzywej (ELISA v1.11, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA) i wyraża w jednostkach ELISA jako procent stężenia surowicy odniesienia.

5. Przechowywanie danych Formularze rekrutacyjne i uzupełniające będą przechowywane w zamkniętym gabinecie. Informacje z formularzy zostaną wprowadzone do komputera za pomocą programu Filemaker Pro 5.5 i zostaną połączone numerem badania i wizyty z danymi laboratoryjnymi.