Dinámica de la respuesta inmune en niños a la vacuna neumocócica capsular de polisacáridos 23-valente (Pneumovax)

Los detalles son los que se describen a continuación:

1. Sitio de estudio Hospital del distrito de Kilifi.
2. Población de estudio y muestreo Los casos y controles de la cohorte de nacimiento de Kilifi que estén vivos al final de la observación de la cohorte (a la edad de 24 meses) y permanezcan residentes en el distrito de Kilifi serán vacunados con una dosis subcutánea única de 0,5 ml de 23 vacuna antineumocócica polisacárida valente (Pneumovax 23) para comparar la dinámica de la respuesta de anticuerpos anticapsulares a 5 antígenos capsulares elegidos para representar diferentes perfiles inmunológicos de los polisacáridos capsulares neumocócicos (1, 6B, 14, 19F, 23F).

3. Reclutamiento Se identificarán los posibles sujetos del estudio y se abordará a sus madres, se les informará sobre el estudio, incluida la necesidad de someterse a la prueba del VIH, y se les invitará a participar. Un trabajador de campo explicará la justificación y los procedimientos del estudio y le dará a la madre una hoja de información/formulario de consentimiento para que se la lleve. A la madre también se le entregará un comprobante de cita y una tarifa para regresar al hospital en la fecha de la cita. Las citas serán en el pabellón 1. Cuando la madre regrese, el trabajador de campo volverá a revisar el formulario de consentimiento y le pedirá a la madre que lo firme. Se asesorará a la madre y se realizará la prueba del VIH a su hijo. Si el participante es positivo, el niño será derivado a la Clínica Familiar Kilifi. Si el participante es negativo, el niño recibirá la dosis única de Pneumovax (vacuna de polisacáridos 23 valente). A la madre se le dará un cronograma de 2 citas más para análisis de sangre y en cada visita KEMRI proporcionará la tarifa de ida y vuelta al hospital. Los sujetos del estudio que hayan sido vacunados y posteriormente no asistan serán visitados por FW en una motocicleta para invitarlos a asistir a sus citas al día siguiente. Se recopilará información sobre la edad, el sexo y las exposiciones ambientales, tales como: número de hermanos mayores y menores en la casa, exposición al humo de la cocina, tabaquismo pasivo, hospitalización reciente.

   Definición de casos:

   Los casos de ENI, IRA o neumonía y meningitis radiográfica se definirán como episodios de enfermedad, que requieren ingreso hospitalario, que ocurren en miembros de la cohorte entre el nacimiento y los 23 meses de edad que también cumplen al menos una de las siguientes definiciones de síndrome: NEUMOCOCO INVASIVO ENFERMEDAD se define por un resultado positivo en CUALQUIERA de los siguientes criterios: (i) cultivo de S. pneumoniae de cualquier sitio normalmente estéril que incluya sangre, líquido cefalorraquídeo, pulmón, líquido sinovial, pero excluyendo líquido del oído medio e hisopos oculares externos. O (ii) Aumento del doble en la concentración de anticuerpos anti-PsaA medida por ELISA en dos muestras de suero obtenidas con al menos 5 días de diferencia 21 Y presencia en orina de polisacárido capsular neumocócico detectado por ensayo de aglutinación de látex 46. La IRA se define por una historia aguda (<2 semanas) de tos o dificultad para respirar acompañada de una frecuencia respiratoria elevada (≥50/min en un niño <12 meses, ≥40/min en un niño de 12-23 meses). La IRA es grave si además hay tiraje torácico, y muy grave si además hay cianosis central y postración o incapacidad para beber 47.

   La NEUMONIA RADIOGRÁFICA se define como IRA acompañada de consolidación radiográfica. Todas las radiografías serán calificadas tanto por los médicos del estudio como por un radiólogo consultor. La "consolidación radiográfica" solo se considerará presente si ambos observadores la documentan.

   MENINGITIS: La meningitis se está definiendo para apuntar al uso de pruebas de diagnóstico adicionales para la ENI. Se requiere una definición que sea sensible pero no necesariamente altamente específica para la meningitis neumocócica. Cualquier niño que sea transferido a la unidad de alta dependencia de KEMRI con un diagnóstico clínico de "Meningitis", cualquier niño que haya comenzado con el régimen estándar de antibióticos para la meningitis, o cualquier niño con un recuento elevado de leucocitos en el LCR o una proporción de glucosa en LCR/plasma de <0.5 será considerado como un caso de meningitis para los fines de este estudio.

   Un solo episodio de enfermedad puede satisfacer una, dos, tres o todas las definiciones de caso. La definición de IPD es para uso en el estudio de casos y controles. Las otras definiciones se utilizan en el estudio de la incidencia y la etiología de las IRA graves y la neumonía radiográfica y para guiar el flujo de investigaciones de pacientes con sospecha de ENI.

4. Métodos de laboratorio ELISA IGG ANTICAPSULAR. El método de Quataert et al. se utilizará con modificaciones menores 13,14. Se recubren placas de microtitulación de fondo plano (Nunc Maxisorb, Nunc, Finlandia) con 20 μg/ml de polisacárido capsular purificado (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, EE. UU.) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,01 M, pH 7,2, durante 5 horas a 37oC y luego almacenada a 4oC. Las placas se lavan cinco veces con PBS, pH 7,2, con Tween-20 al 0,05% después de cada etapa. Los sueros de prueba se diluyen 1:50 en albúmina de suero bovino al 1 %, Tween-20 al 0,05 % en PBS que contiene 10 μg/ml de polisacárido C (Statens Seruminstitut, Copenhague, Dinamarca) y 20 μg/ml de polisacárido de los serotipos 22F (American Type Culture colección) se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los sueros de prueba se alicuotan en la placa por duplicado en 8 diluciones triples y se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora. Un suero de referencia estándar (89SF, Dr. Carl Frasch, FDA, EE. UU.) y un control (suero posterior a la vacunación de un individuo con buenas respuestas a todos los serotipos vacunales) se analizan en cada placa en siete diluciones triples. El anticuerpo unido se marca con IgG antihumana de cabra conjugada con fosfatasa alcalina en una incubación de 2 horas a temperatura ambiente. La enzima unida se visualiza con fosfato de p-nitrofenilo en sustrato de dietanolamina (Sigma) durante 2 horas a temperatura ambiente y la reacción se detiene con NaOH 3M. Las placas se leen con un lector ELISA a una longitud de onda de 450 nm con un filtro de referencia de 620 nm. Los resultados se analizan mediante un programa de ajuste de curva logarítmica logística de 4 parámetros (ELISA v1.11, Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, Atlanta, GA) y se expresan en relación con las concentraciones conocidas del suero de referencia.

   ELISA PARA ANTI-PSAA: El método de Tharpe et al. se utilizará en pares o triplicados de sueros. Se recubren placas de microtitulación de fondo plano (Immunlon II HB, Dynatech Corp, Chantilly, VA) con 2,5 μg/ml de PsaA purificada en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,01 M, pH 7,2, durante 16 horas a 4 °C. PsaA se produce por recombinación y expresión en Escherichia coli del gen que codifica PsaA. Las placas se lavan cuatro veces con PBS, pH 7,2, con Tween-20 al 0,05 % después de cada etapa excepto el bloqueo, cuando las placas simplemente se vacían. Las placas se bloquean durante 1 hora a 37oC con albúmina de suero bovino al 1% (Grado EIA, Sigma Chemical Co., St Louise, MO) 10 mg/L en PBS. Los sueros de prueba se diluyen en albúmina de suero bovino al 1%, Tween-20 al 0,05% en PBS y se incuban durante 1 hora a 37oC. Los sueros de prueba se analizan por duplicado en 8 diluciones dobles y todos los sueros de un paciente se analizan en la misma placa. Un suero de referencia de alta concentración de anti-PsaA y un control (Sandoglobulin, Sandoz, Suiza) se analizan en cada placa en siete diluciones dobles. El anticuerpo unido se marca con IgG-Fc antihumano monoclonal de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (clon PH6043, Hybridoma Reagent Laboratories, Baltimore, MD) en una incubación de 2 horas a 37oC. La enzima unida se visualiza con tetrametilbencidina (sustrato de peroxidasa de micropocillos de 1 componente TMB, Kirkegaard and Perry Laboratories Inc, Gaithersburg, MD) durante 30 minutos a temperatura ambiente y la reacción se detiene con ácido sulfúrico 0,18 M. Las placas se leen con un lector ELISA a una longitud de onda de 450 nm con un filtro de referencia de 620 nm. Los resultados se analizan mediante un programa de ajuste de curva logarítmica logística de 4 parámetros (ELISA v1.11, Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, Atlanta, GA) y se expresan en unidades ELISA como porcentaje de la concentración del suero de referencia.

5. Almacenamiento de datos Los formularios de reclutamiento y seguimiento se almacenarán en una oficina del estudio cerrada con llave. La información de los formularios se ingresará en una computadora usando Filemaker Pro 5.5 y se vinculará con el número de estudio y la visita con los datos del laboratorio.