Динамика иммунного ответа у детей на 23-валентную пневмококковую капсулярно-полисахаридную вакцину (пневмовакс)

Подробности описаны ниже:

1. Место исследования Килифийская районная больница.
2. Исследуемая популяция и выборка Случаи и контрольная группа из когорты новорожденных в Килифи, которые выжили в конце когортного наблюдения (в возрасте 24 месяцев) и остаются проживающими в районе Килифи, будут вакцинированы однократной дозой 0,5 мл подкожно 23 валентная пневмококковая полисахаридная вакцина (Пневмовакс 23) для сравнения динамики ответа антикапсулярных антител на 5 капсульных антигенов, выбранных для представления различных иммунологических профилей пневмококковых капсулярных полисахаридов (1, 6B, 14, 19F, 23F).

3. Набор участников Будут определены потенциальные участники исследования, и их матерям будет предложено пройти исследование, в том числе о необходимости пройти тестирование на ВИЧ, и им будет предложено принять участие. Полевой работник объяснит обоснование и процедуры исследования и даст матери информационный лист/форму согласия, которую она должна забрать. Матери также будет выдан талон на прием и плата за проезд, чтобы вернуться в больницу в назначенный день. Прием будет в отделении 1. Когда мать вернется, полевой работник снова заполнит форму согласия и попросит мать подписать ее. Мать проконсультируют, а ее ребенку сделают тест на ВИЧ. Если участник положительный, ребенок будет направлен в семейную клинику Килифи. Если участник отрицательный, ребенок получит однократную дозу Пневмовакса (23-валентная полисахаридная вакцина). Матери будет предоставлен график 2 дополнительных посещений для анализов крови, и при каждом посещении стоимость проезда в больницу и из больницы будет обеспечиваться KEMRI. Субъекты исследования, которые были вакцинированы и впоследствии не посещали, будут посещены FW на мотоцикле, чтобы пригласить их на прием на следующий день. Будет собираться информация о возрасте, поле и воздействии окружающей среды, например: количество старших и младших братьев и сестер в доме, воздействие дыма при приготовлении пищи, пассивное курение сигарет, недавняя госпитализация.

   Определение случаев:

   Случаи ИПЗ, ОРЗ или рентгенографической пневмонии и менингита будут определяться как эпизоды заболевания, требующие госпитализации, возникающие у членов когорты в возрасте от рождения до 23 месяцев, которые также соответствуют по крайней мере одному из следующих определений синдрома: ИНВАЗИВНЫЙ ПНЕВМОКОККОВЫЙ ЗАБОЛЕВАНИЕ определяется положительным результатом по ОДНОМУ из следующих критериев: (i) посев S. pneumoniae из любого нормально стерильного места, включая кровь, спинномозговую жидкость, легкие, синовиальную жидкость, но исключая жидкость из среднего уха и мазки из глаз. ИЛИ (ii) Двукратное повышение концентрации антител против PsaA, измеренное с помощью ELISA в двух образцах сыворотки, полученных с интервалом не менее 5 дней 21, И присутствие в моче пневмококкового капсулярного полисахарида, обнаруженное методом латексной агглютинации 46. ОРИ определяется острым (<2 нед) кашлем или затрудненным дыханием в анамнезе, сопровождающимся учащением дыхания (≥50/мин у ребенка <12 мес, ≥40/мин у ребенка 12-23 мес). ОРИ считается тяжелым, если к тому же имеется втяжение грудной клетки, и очень тяжелым, если к тому же имеется центральный цианоз и прострация или неспособность пить 47.

   РЕНТГЕНОВСКАЯ ПНЕВМОНИЯ определяется как ОРЗ, сопровождающаяся рентгенологической консолидацией. Все рентгенограммы будут оцениваться как врачами-исследователями, так и радиологом-консультантом. «Рентгенографическое уплотнение» будет считаться присутствующим только в том случае, если оно задокументировано обоими наблюдателями.

   МЕНИНГИТ: Менингит определяется с целью использования дополнительных диагностических тестов на ИПЗ. Требуется определение, которое является чувствительным, но не обязательно высоко специфичным для пневмококкового менингита. Любой ребенок, переведенный в отделение интенсивной терапии KEMRI с клиническим диагнозом «Менингит», любой ребенок, начавший лечение антибиотиками по стандартной схеме лечения менингита, или любой ребенок с повышенным числом лейкоцитов в спинномозговой жидкости или соотношением глюкозы в спинномозговой жидкости/плазме <0,5, будет рассматривается как случай менингита для целей настоящего исследования.

   Отдельный эпизод болезни может удовлетворять одному, двум, трем или всем определениям случая. Определение ИЗИ предназначено для использования в исследовании случай-контроль. Другие определения предназначены для использования при изучении заболеваемости и этиологии тяжелых ОРЗ и рентгенографической пневмонии, а также для управления потоком исследований пациентов с подозрением на ИПЗ.

4. Лабораторные методы ИФА против капсулярных IGG. Метод Quataert et al. будет использоваться с небольшими изменениями 13,14. Планшеты для микротитрования с плоским дном (Nunc Maxisorb, Nunc, Финляндия) покрывают 20 мкг/мл очищенного капсулярного полисахарида (Американская коллекция типовых культур, Манассас, Вирджиния, США) в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (PBS), pH 7,2, в течение 5 часов. при 37°С, а затем хранят при 4°С. Планшеты промывают пять раз PBS, pH 7,2, с 0,05% Tween-20 после каждого этапа. Тестовые сыворотки разводят 1:50 в 1% бычьем сывороточном альбумине, 0,05% Tween-20 в PBS, содержащем 10 мкг/мл C-полисахарида (Statens Seruminstitut, Копенгаген, Дания) и 20 мкг/мл полисахарида серотипов 22F (American Type Culture). Сбор) инкубируют 30 мин при комнатной температуре. На планшет наносят аликвоты тест-сыворотки в 8-кратном трехкратном разведении и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа. Стандартную эталонную сыворотку (89SF, Dr Carl Frasch, FDA, США) и контрольную (послевакцинальную сыворотку от человека с хорошим ответом на все серотипы вакцины) анализируют на каждой чашке в семи 3-кратных разведениях. Связанное антитело метят конъюгированным с щелочной фосфатазой козьим античеловеческим IgG в течение 2 часов инкубации при комнатной температуре. Связанный фермент визуализируют п-нитрофенилфосфатом в диэтаноламиновом субстрате (Sigma) в течение 2 часов при комнатной температуре и реакцию останавливают 3М NaOH. Планшеты считывают с помощью считывателя ELISA при длине волны 450 нм с эталонным фильтром 620 нм. Результаты анализируют с помощью программы подбора логистической логарифмической кривой с 4 параметрами (ELISA v1.11, Центры по контролю и профилактике заболеваний, Атланта, Джорджия) и выражают по отношению к известным концентрациям эталонной сыворотки.

   ИФА НА АНТИ-PSAA: метод Tharpe et al. будет использоваться для пар или троек сывороток. Планшеты для микротитрования с плоским дном (Immunlon II HB, Dynatech Corp, Chantilly, VA) покрывают 2,5 мкг/мл очищенного PsaA в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (PBS), pH 7,2, на 16 часов при 4oC. PsaA продуцируется путем рекомбинации и экспрессии в Escherichia coli гена, кодирующего PsaA. Планшеты промывают четыре раза PBS, pH 7,2, с 0,05% Tween-20 после каждой стадии, кроме блокировки, когда планшеты просто опорожняют. Планшеты блокируют на 1 час при 37oC 1% бычьим сывороточным альбумином (класс EIA, Sigma Chemical Co., St Louise, MO) 10 мг/л в PBS. Тестовые сыворотки разбавляют 1% бычьим сывороточным альбумином, 0,05% твином-20 в PBS и инкубируют 1 час при 37°С. Тестовые сыворотки анализируют в двух повторах в 8 двукратных разведениях и все сыворотки от одного пациента анализируют на одной и той же чашке. Эталонную сыворотку с высокой концентрацией анти-PsaA и контрольную (Сандоглобулин, Sandoz, Швейцария) анализируют на каждой чашке в семи двукратных разведениях. Связанное антитело метят мышиным моноклональным антителом против IgG-Fc человека, конъюгированным с пероксидазой хрена (клон PH6043, Hybridoma Reagent Laboratories, Baltimore, MD) в течение 2 часов инкубации при 37oC. Связанный фермент визуализируют тетраметилбензидином (1-компонентный микролуночный субстрат пероксидазы TMB, Kirkegaard and Perry Laboratories Inc, Gaithersburg, MD) в течение 30 минут при комнатной температуре, и реакцию останавливают 0,18 М серной кислотой. Планшеты считывают с помощью считывателя ELISA при длине волны 450 нм с эталонным фильтром 620 нм. Результаты анализируют с помощью программы подбора логарифмической кривой с 4 параметрами (ELISA v1.11, Центры по контролю и профилактике заболеваний, Атланта, Джорджия) и выражают в единицах ELISA в процентах от концентрации эталонной сыворотки.

5. Хранение данных. Формы набора и последующих действий будут храниться в закрытом учебном кабинете. Информация из форм будет введена в компьютер с помощью Filemaker Pro 5.5 и будет привязана к номеру исследования и посещению с лабораторными данными.