Dynamik der Immunantwort bei Kindern auf den 23-valenten Pneumokokken-Kapselpolysaccharid-Impfstoff (Pneumovax)

Die Details sind wie folgt beschrieben:

1. Studienort Kilifi District Hospital.
2. Studienpopulation und Probenahme Fälle und Kontrollen aus der Kilifi-Geburtskohorte, die am Ende der Kohortenbeobachtung (im Alter von 24 Monaten) leben und weiterhin im Bezirk Kilifi ansässig sind, werden mit einer subkutanen Einzeldosis von 0,5 ml von 23 geimpft valenter Pneumokokken-Polysaccharid-Impfstoff (Pneumovax 23), um die Dynamik der Anti-Kapsel-Antikörperantwort auf 5 Kapsel-Antigene zu vergleichen, die ausgewählt wurden, um unterschiedliche immunologische Profile der Pneumokokken-Kapsel-Polysaccharide darzustellen (1, 6B, 14, 19F, 23F).

3. Rekrutierung Potenzielle Studienteilnehmer werden identifiziert und ihre Mütter werden angesprochen, über die Studie einschließlich der Notwendigkeit eines HIV-Tests informiert und zur Teilnahme eingeladen. Ein Außendienstmitarbeiter erklärt die Gründe und Verfahren für die Studie und gibt der Mutter ein Informationsblatt/Einverständniserklärung zum Mitnehmen. Die Mutter erhält außerdem einen Terminzettel und einen Fahrpreis für die Rückkehr ins Krankenhaus am Termin. Die Termine finden auf Station 1 statt. Wenn die Mutter zurückkommt, geht der Außendienstmitarbeiter die Einwilligungserklärung erneut durch und bittet die Mutter, sie zu unterschreiben. Die Mutter wird beraten und ihr Kind auf HIV getestet. Wenn der Teilnehmer positiv ist, wird das Kind an die Kilifi Family Clinic überwiesen. Wenn der Teilnehmer negativ ist, erhält das Kind die Einzeldosis Pneumovax (23-valenter Polysaccharid-Impfstoff). Die Mutter erhält einen Zeitplan mit 2 weiteren Terminen für Blutuntersuchungen und bei jedem Besuch wird der Fahrpreis zum und vom Krankenhaus von KEMRI übernommen. Studienteilnehmer, die geimpft wurden und später nicht teilnehmen, werden von FW auf einem Motorrad besucht, um sie einzuladen, ihre Termine gleich am nächsten Tag wahrzunehmen. Es werden Informationen zu Alter, Geschlecht und Umweltbelastungen gesammelt, wie z. B.: Anzahl der älteren und jüngeren Geschwister im Haus, Rauchbelastung beim Kochen, Passivrauchen, kürzliche Krankenhauseinweisung.

   Definition von Fällen:

   Fälle von IPD, ARI oder Röntgenpneumonie und Meningitis werden als Krankheitsepisoden definiert, die eine Krankenhauseinweisung erfordern und bei Kohortenmitgliedern zwischen der Geburt und dem Alter von 23 Monaten auftreten, die auch mindestens eine der folgenden Syndromdefinitionen erfüllen: INVASIVE PNEUMOKOKKEN KRANKHEIT wird durch ein positives Ergebnis bei EINEM der folgenden Kriterien definiert: (i) Kultur von S. pneumoniae von jeder normalerweise sterilen Stelle, einschließlich Blut, Liquor, Lunge, Synovialflüssigkeit, aber ausgenommen Mittelohrflüssigkeit und äußere Augenabstriche. ODER (ii) Zweifacher Anstieg der Anti-PsaA-Antikörperkonzentration, gemessen durch ELISA in zwei Serumproben, die im Abstand von mindestens 5 Tagen entnommen wurden 21 UND Vorhandensein von Pneumokokken-Kapselpolysaccharid im Urin, nachgewiesen durch Latex-Agglutinationstest 46. ARI ist definiert durch eine akute (< 2 Wochen) Vorgeschichte von Husten oder Atembeschwerden, begleitet von einer erhöhten Atemfrequenz (≥ 50/min bei einem Kind < 12 Monate, ≥ 40/min bei einem Kind 12-23 Monate). ARI ist schwer, wenn zusätzlich ein Einziehen in die Brust besteht, und sehr schwer, wenn zusätzlich zentrale Zyanose und Erschöpfung oder Unfähigkeit zu trinken 47.

   RÖNTGENPNEUMONIE ist definiert als ARI, begleitet von einer röntgenologischen Konsolidierung. Alle Röntgenaufnahmen werden sowohl von den Studienärzten als auch von einem beratenden Radiologen bewertet. Eine „Röntgenkonsolidierung“ gilt nur dann als vorhanden, wenn sie von beiden Beobachtern dokumentiert wird.

   MENINGITIS: Meningitis wird definiert, um auf die Verwendung zusätzlicher diagnostischer Tests für IPD abzuzielen. Es ist eine Definition erforderlich, die sensibel, aber nicht unbedingt hochspezifisch für Pneumokokken-Meningitis ist. Jedes Kind, das mit einer klinischen Diagnose von „Meningitis“ in die KEMRI-Einheit für hohe Abhängigkeit verlegt wird, jedes Kind, das mit dem Standard-Meningitis-Antibiotika-Regime begonnen hat, oder jedes Kind mit einer erhöhten CSF-Leukozytenzahl oder einem CSF/Plasma-Glukose-Verhältnis von <0,5 wird für die Zwecke dieser Studie als Fall von Meningitis angesehen.

   Eine einzelne Krankheitsepisode kann eine, zwei, drei oder alle Falldefinitionen erfüllen. Die Definition von IPD dient der Verwendung in der Fall-Kontroll-Studie. Die anderen Definitionen dienen der Untersuchung der Inzidenz und Ätiologie von schwerer ARI und radiologischer Pneumonie und zur Lenkung des Untersuchungsablaufs bei Patienten mit Verdacht auf IPD.

4. Labormethoden ANTI-CAPSULAR IGG ELISA. Das Verfahren von Quataert et al. wird mit geringfügigen Modifikationen verwendet 13,14. Mikrotiterplatten mit flachem Boden (Nunc Maxisorb, Nunc, Finnland) werden mit 20 &mgr;g/ml gereinigtem Kapselpolysaccharid (American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA) in 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,2, für 5 Stunden beschichtet bei 37oC und dann bei 4oC gelagert. Die Platten werden fünfmal mit PBS, pH 7,2, mit 0,05 % Tween-20 nach jeder Stufe gewaschen. Testseren werden 1:50 in 1 % Rinderserumalbumin, 0,05 % Tween-20 in PBS verdünnt, das 10 μg/ml C-Polysaccharid (Statens Seruminstitut, Kopenhagen, Dänemark) und 20 μg/ml Polysaccharid der Serotypen 22F (American Type Culture Sammlung) für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Testseren werden in zweifacher Ausfertigung in 8 dreifachen Verdünnungen auf die Platte aliquotiert und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Ein Standard-Referenzserum (89SF, Dr. Carl Frasch, FDA, USA) und eine Kontrolle (Serum nach der Impfung von einer Person mit gutem Ansprechen auf alle Impfstoff-Serotypen) werden auf jeder Platte in sieben 3-fachen Verdünnungen getestet. Gebundener Antikörper wird mit alkalischer Phosphatase-konjugiertem Ziegen-Anti-Mensch-IgG in einer 2-stündigen Inkubation bei Raumtemperatur markiert. Gebundenes Enzym wird mit p-Nitrophenylphosphat in Diethanolaminsubstrat (Sigma) für 2 Stunden bei Raumtemperatur sichtbar gemacht und die Reaktion wird mit 3 M NaOH gestoppt. Die Platten werden von einem ELISA-Lesegerät bei einer Wellenlänge von 450 nm mit einem Referenzfilter von 620 nm gelesen. Die Ergebnisse werden durch ein logistisches 4-Parameter-Kurvenanpassungsprogramm (ELISA v1.11, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA) analysiert und in Relation zu den bekannten Konzentrationen des Referenzserums ausgedrückt.

   ELISA FÜR ANTI-PSAA: Das Verfahren von Tharpe et al. wird bei Serenpaaren oder -triplikaten verwendet. Mikrotiterplatten mit flachem Boden (Immunlon II HB, Dynatech Corp, Chantilly, VA) werden mit 2,5 &mgr;g/ml gereinigtem PsaA in 0,01 M phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,2, für 16 Stunden bei 4°C beschichtet. PsaA wird durch Rekombination und Expression des für PsaA codierenden Gens in Escherichia coli produziert. Die Platten werden viermal mit PBS, pH 7,2, mit 0,05 % Tween-20 nach jeder Stufe gewaschen, mit Ausnahme des Blockierens, wenn die Platten einfach geleert werden. Die Platten werden für 1 Stunde bei 37°C mit 1 % Rinderserumalbumin (EIA-Qualität, Sigma Chemical Co., St. Louise, MO) 10 mg/l in PBS blockiert. Testseren werden in 1 % Rinderserumalbumin, 0,05 % Tween-20 in PBS verdünnt und 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Testseren werden in zweifacher Ausfertigung in 8 zweifachen Verdünnungen getestet und alle Seren eines Patienten werden auf derselben Platte getestet. Ein Referenzserum mit hoher Anti-PsaA-Konzentration und eine Kontrolle (Sandoglobulin, Sandoz, Schweiz) werden auf jeder Platte in sieben 2-fachen Verdünnungen getestet. Gebundener Antikörper wird mit monoklonalem Maus-Anti-Mensch-IgG-Fc, konjugiert an Meerrettichperoxidase (Klon PH6043, Hybridoma Reagent Laboratories, Baltimore, MD) in einer 2-stündigen Inkubation bei 37°C markiert. Gebundenes Enzym wird mit Tetramethylbenzidin (TMB-1-Komponenten-Mikrovertiefungs-Peroxidasesubstrat, Kirkegaard und Perry Laboratories Inc, Gaithersburg, MD) für 30 Minuten bei Raumtemperatur sichtbar gemacht und die Reaktion wird mit 0,18 M Schwefelsäure gestoppt. Die Platten werden von einem ELISA-Lesegerät bei einer Wellenlänge von 450 nm mit einem Referenzfilter von 620 nm gelesen. Die Ergebnisse werden durch ein 4-Parameter-Logistik-Log-Kurvenanpassungsprogramm (ELISA v1.11, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA) analysiert und in ELISA-Einheiten als Prozentsatz der Konzentration des Referenzserums ausgedrückt.

5. Datenspeicherung Rekrutierungs- und Nachbereitungsformulare werden in einem abgeschlossenen Studienbüro aufbewahrt. Informationen aus den Formularen werden mit Filemaker Pro 5.5 in einen Computer eingegeben und über Studiennummer und Besuch mit den Labordaten verknüpft.