Efficacité de la thérapie plasma convalescente chez les patients gravement malades atteints de COVID-19

Pour les donateurs :

Les plaques de microtitration seront recouvertes pendant une nuit à 4 ° C avec 4 μg / ml de protéines recombinantes SARS-CoV-2 RBD (domaine de liaison au récepteur) (50 μL par puits). Les plaques seront lavées 3 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,1 % vol/vol de Tween-20 (PBST) et bloquées avec une solution de blocage (PBS contenant 2 % wt/vol de lait écrémé en poudre) pendant 2 heures à 37 ° C Les plaques seront ensuite lavées au PBST. Les échantillons de sérum seront dilués à 200 fois dans du PBS comme concentration initiale, et des dilutions en série de 3 fois de sérum seront ajoutées aux puits et incubées à 37 ° C pendant 60 minutes. Après 3 lavages, 100 μL de solution d'anticorps anti-IgG humaine de chèvre (pour la détection du titre d'anticorps IgG) et IgM (pour la détection du titre d'anticorps IgM) conjugués à la peroxydase de raifort seront ajoutés à chaque plaque, respectivement, et incubés à 37 °C pendant 60 minutes. Après 5 lavages, 100 μL de substrat tétraméthylbenzidine seront ajoutés à température ambiante dans l'obscurité. Après 15 minutes, la réaction sera arrêtée avec une solution de 2MH2SO4 (acide sulfurique). L'absorbance sera mesurée à 450nm. Tous les échantillons seront exécutés en triple exemplaire. Les titres d'IgG seront déterminés par dilution au point final.

Des cellules Vero (104) seront ensemencées 24 heures avant l'infection dans une plaque 96 puits. Le jour de l'infection, les cellules seront lavées deux fois. Les échantillons de sérum des patients seront incubés à 56 °C pendant 30 minutes puis dilués 2 fois dans un milieu de culture cellulaire (milieu d'aigle modifié). Des aliquotes (40 μL) d'échantillons de sérum dilués (de 2 fois à 2056 fois) seront ajoutés à 50 μL de milieu de culture cellulaire contenant 50 fois la dose infectieuse de culture tissulaire (TCID50) de la souche virale sur une plaque de 96 puits et incubé à 37 °C pendant 2 heures dans du CO2 5 % vol/vol. Un mélange d'anticorps anti-virus sera ajouté aux cellules dans des plaques à 96 puits et les plaques seront incubées à 37 ° C avec un examen microscopique pour l'effet cytopathique après 5 jours d'incubation. La dilution la plus élevée de sérum qui a montré une activité d'inhibition du SARS-CoV-2 sera enregistrée comme titre d'anticorps neutralisant. Les tests seront effectués en triple avec des échantillons témoins négatifs provenant de volontaires sains.

Pour les destinataires :

Le sérum de chaque receveur sera obtenu et le dosage immuno-enzymatique (ELISA) et les titres d'anticorps neutralisants seront testés un jour avant la transfusion de plasma convalescent. Les modifications du titre d'IgG spécifiques au domaine de liaison au récepteur et des titres d'anticorps neutralisants avant et après la transfusion de plasma convalescent chez les patients seront obtenues au jour 0, au jour 1, au jour 3 et au jour 7. si possible.

Tous les patients inclus seraient randomisés pour recevoir soit un traitement médical standard (traitement de soutien) avec du plasma de donneur aléatoire, soit du plasma convalescent et un traitement médical standard. Les informations cliniques de tous les patients inscrits, y compris les symptômes lors de la présentation, le délai de présentation à l'hôpital et le développement être enregistré. Les détails des maladies comorbides mesurés par l'indice de comorbidité de Charlson et l'évaluation de la physiologie aiguë et de la santé chronique II (APACHE II). Les détails de l'imagerie en coupe, de la radiographie pulmonaire, des co-infections bactériennes ou fongiques et les détails du traitement antibiotique seraient enregistrés. Le développement de complications, notamment une lésion rénale aiguë, un syndrome coronarien aigu, une myocardite, un syndrome de détresse respiratoire aiguë et une infection nosocomiale, sera enregistré. L'utilisation d'oxygène à haut débit, de ventilation non invasive et invasive suivra les directives standard et sera enregistrée. Les détails du traitement antiviral, y compris l'oseltamivir par voie orale, l'hydroxychloroquine et l'utilisation de stéroïdes intraveineux, seront enregistrés pour tous les patients inscrits.