Эффективность реконвалесцентной плазмотерапии у тяжелобольных пациентов с COVID-19

Для доноров:

Планшеты для микротитрования покрывают в течение ночи при 4°C 4 мкг/мл рекомбинантных белков RBD (рецептор-связывающий домен) SARS-CoV-2 (50 мкл на лунку). Планшеты промывают 3 раза фосфатно-солевым буфером (PBS), содержащим 0,1% об./об. Tween-20 (PBST), и блокируют блокирующим раствором (PBS, содержащим 2% вес./об. обезжиренного сухого молока) в течение 2 часов при 37°С. С. Затем планшеты промывают PBST. Образцы сыворотки будут разбавлены в 200 раз в PBS в качестве начальной концентрации, а серийные 3-кратные разведения сыворотки будут добавлены в лунки и инкубированы при 37 ° C в течение 60 минут. После 3 промывок в каждый планшет добавляют 100 мкл раствора козьих антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, против IgG человека (для определения титра антител IgG) и IgM (для определения титра антител IgM) соответственно и инкубируют при 37 °C в течение 60 минут. После 5 промывок добавляют 100 мкл тетраметилбензидинового субстрата при комнатной температуре в темноте. Через 15 минут реакцию останавливают раствором 2MH2SO4 (серная кислота). Поглощение будет измеряться при 450 нм. Все образцы будут запускаться в трех экземплярах. Титры IgG будут определяться конечным разведением.

Анализ нейтрализации сыворотки Клетки Vero (104) высевают за 24 часа до инфицирования в 96-луночный планшет. В день заражения клетки дважды промывают. Образцы сыворотки пациентов инкубируют при 56°C в течение 30 минут, а затем разбавляют в 2 раза в среде для культивирования клеток (модифицированная среда Игла). Аликвоты (40 мкл) разведенных образцов сыворотки (от 2-кратного до 2056-кратного) будут добавлены к 50 мкл среды для культивирования клеток, содержащей 50-кратную инфекционную дозу культуры ткани (TCID50) штамма вируса на 96-луночном планшете и инкубировали при 37°C в течение 2 часов в CO2 5% об./об. Смесь вирусных антител будет добавлена ​​к клеткам в 96-луночных планшетах, и планшеты будут инкубированы при 37 ° C с микроскопическим исследованием цитопатического эффекта после 5-дневной инкубации. Самое высокое разведение сыворотки, которое показало ингибирующую активность SARS-CoV-2, будет зарегистрировано как титр нейтрализующих антител. Анализы будут проводиться в трех повторностях с отрицательными контрольными образцами от здоровых добровольцев.

Для получателей:

Будет получена сыворотка каждого реципиента, и за день до переливания реконвалесцентной плазмы будут проверены иммуноферментный анализ (ИФА) и титры нейтрализующих антител. Изменения титра IgG, специфичного к домену связывания рецептора, и титров нейтрализующих антител до и после переливания плазмы выздоравливающих пациентов будут получены в день 0, день 1, день 3 и день 7, если это возможно.

Все включенные пациенты будут рандомизированы для получения либо стандартной медикаментозной терапии (поддерживающая терапия) со случайной донорской плазмой по сравнению с плазмой выздоравливающих и стандартной медикаментозной терапией. быть записаны. Подробная информация о сопутствующих заболеваниях, измеренная с помощью индекса сопутствующих заболеваний Чарльсона и оценки острой физиологии и хронического состояния здоровья II (APACHE II). Подробная информация о поперечном сечении, рентгенографии грудной клетки, бактериальных или грибковых коинфекциях и подробности лечения антибиотиками будут записаны. Будет зарегистрировано развитие осложнений, включая острое повреждение почек, острый коронарный синдром, миокардит, острый респираторный дистресс-синдром и внутрибольничную инфекцию. Использование высокопоточной оксигенации, неинвазивной и инвазивной вентиляции будет соответствовать стандартным рекомендациям и будет регистрироваться. Детали противовирусного лечения, включая пероральный прием осельтамивира, гидроксихлорохина и внутривенное введение стероидов, будут зарегистрированы для всех включенных в исследование пациентов.