Effekten av rekonvalesentplasmaterapi hos alvorlig syke COVID-19-pasienter

For givere:

Mikrotiterplater vil bli belagt over natten ved 4 °C med 4 μg/mL rekombinante SARS-CoV-2 RBD (reseptorbindende domene) proteiner (50 μL per brønn). Platene vil bli vasket 3 ganger med fosfatbufret saltvann (PBS) som inneholder 0,1 % vol/vol Tween-20(PBST) og blokkert med blokkeringsløsning (PBS som inneholder 2 % vekt/vol fettfri tørrmelk) i 2 timer ved 37 ° C. Platene blir deretter vasket med PBST. Serumprøvene vil bli fortynnet til 200 ganger inn i PBS som startkonsentrasjon, og 3-gangers serumfortynninger vil bli tilsatt til brønnene og inkubert ved 37 °C i 60 minutter. Etter 3 vask, vil 100 μL av pepperrotperoksidase-konjugert geit-anti-humant IgG (for IgG-antistofftiterdeteksjon) og IgM (for IgM-antistofftiterdeteksjon) antistoffløsning tilsettes til hver plate, og inkuberes ved 37 °C for 60 minutter. Etter 5 vask vil 100 μL tetrametylbenzidinsubstrat tilsettes ved romtemperatur i mørket. Etter 15 minutter vil reaksjonen bli stoppet med en 2MH2SO4-løsning (svovelsyre). Absorbansen vil bli målt ved 450nm. Alle prøver kjøres i tre eksemplarer. IgG-titrene vil bli bestemt ved endepunktfortynning.

Serumnøytraliseringsanalyse Vero-celler (104) blir sådd 24 timer før infeksjonen i en 96-brønners plate. På infeksjonsdagen vil cellene vaskes to ganger. Serumprøver fra pasienter vil bli inkubert ved 56 °C i 30 minutter og deretter fortynnet 2 ganger i cellekulturmedium (modifisert ørnemedium). Alikvoter (40 μL) av fortynnede serumprøver (fra 2 ganger til 2056 ganger) vil bli tilsatt 50 μL cellekulturmedium som inneholder 50 ganger vevskulturinfeksiøs dose (TCID50) av virusstammen på en 96-brønners plate og inkubert ved 37 °C i 2 timer i CO2 5 % vol/vol. Virusantistoffblanding vil bli tilsatt celler i 96-brønners plater og plater vil bli inkubert ved 37 °C med en mikroskopisk undersøkelse for cytopatisk effekt etter 5-dagers inkubasjon. Den høyeste fortynningen av serum som viste hemmende aktivitet av SARS-CoV-2 vil bli registrert som nøytraliserende antistofftiter. Analyser vil bli utført i tre eksemplarer med negative kontrollprøver fra friske frivillige.

For mottakere:

Serumet til hver mottaker vil bli innhentet, og enzymkoblet immunosorbentanalyse (ELISA) og nøytraliserende antistofftitere vil bli testet en dag før rekonvalesent plasmatransfusjon. Endringer av reseptorbindende domenespesifikke IgG-titere og nøytraliserende antistofftitere før og etter rekonvalesent plasmatransfusjon hos pasienter vil bli oppnådd på dag 0, dag 1, dag 3 og dag 7. hvis mulig.

Alle inkluderte pasienter vil bli randomisert til å motta enten standard medisinsk terapi (støttende terapi) med tilfeldig donorplasma versus rekonvalesent plasma og standard medisinsk terapi. Klinisk informasjon om alle påmeldte pasienter inkludert symptomer ved presentasjon, tid til presentasjon til sykehuset og utvikling av lungesymptomer vil bli registrert. Detaljene om komorbide sykdommer målt ved Charlson-indeksen for komorbiditet og akutt fysiologi og kronisk helseevaluering II (APACHE II). Detaljer om tverrsnittsavbildning, røntgen av thorax, bakterie- eller soppinfeksjoner og detaljer om antibiotikabehandling vil bli registrert. Utvikling av komplikasjoner inkludert akutt nyreskade, akutt koronarsyndrom, myokarditt, akutt respiratorisk distress-syndrom og sykehusinfeksjon vil bli registrert. Bruk av høystrøms oksygen, ikke-invasiv og invasiv ventilasjon vil følge standard retningslinjer og vil bli registrert. Detaljene om antiviral behandling inkludert oral oseltamivir, hydroksyklorokin og bruk av intravenøse steroider vil bli registrert for alle påmeldte pasienter.