Effekten af ​​rekonvalescent plasmaterapi hos svært syge COVID-19-patienter

For donorer:

Mikrotiterplader vil blive coatet natten over ved 4°C med 4 μg/mL rekombinante SARS-CoV-2 RBD (receptorbindingsdomæne) proteiner (50 μL pr. brønd). Pladerne vaskes 3 gange med phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 0,1% vol/vol Tween-20(PBST) og blokeres med blokeringsopløsning (PBS indeholdende 2% vægt/vol fedtfri tørmælk) i 2 timer ved 37° C. Pladerne vil derefter blive vasket med PBST. Serumprøverne vil blive fortyndet til 200 gange i PBS som startkoncentration, og serielle 3-dobbelte fortyndinger af serum vil blive tilsat til brøndene og inkuberet ved 37 °C i 60 minutter. Efter 3 vaske tilsættes henholdsvis 100 μL peberrodsperoxidase-konjugeret gede-anti-humant IgG (til IgG-antistoftiterdetektion) og IgM (til IgM-antistoftiterdetektion) antistofopløsning til hver plade og inkuberes ved 37 °C for 60 minutter. Efter 5 vaske tilsættes 100 μL tetramethylbenzidinsubstrat ved stuetemperatur i mørke. Efter 15 minutter vil reaktionen blive standset med en 2MH2SO4-opløsning (svovlsyre). Absorbansen vil blive målt ved 450nm. Alle prøver vil blive kørt i tre eksemplarer. IgG-titrene vil blive bestemt ved endepunktsfortynding.

Serumneutraliseringsassay Vero-celler (104) bliver podet 24 timer før infektionen i en 96-brønds plade. På infektionsdagen vil cellerne blive vasket to gange. Serumprøver fra patienter vil blive inkuberet ved 56 °C i 30 minutter og derefter fortyndet 2 gange i cellekulturmedium (modificeret ørnemedium). Alikvoter (40 μL) af fortyndede serumprøver (fra 2 gange til 2056 gange) vil blive tilsat til 50 μL cellekulturmedium indeholdende 50 gange den vævskulturinfektive dosis (TCID50) af virusstammen på en 96-brønds plade og inkuberet ved 37 °C i 2 timer i CO2 5 % vol/vol. Virusantistofblanding vil blive tilsat til celler i 96-brønds plader, og plader vil blive inkuberet ved 37 °C med en mikroskopisk undersøgelse for cytopatisk effekt efter 5-dages inkubation. Den højeste fortynding af serum, der viste hæmningsaktivitet af SARS-CoV-2, vil blive registreret som den neutraliserende antistoftiter. Assays vil blive udført i tre eksemplarer med negative kontrolprøver fra raske frivillige.

For modtagere:

Serumet fra hver modtager vil blive opnået, og enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) og neutraliserende antistoftitere vil blive testet en dag før den rekonvalescente plasmatransfusion. Ændringer af receptorbindingsdomænespecifik IgG-titer og neutraliserende antistoftitre før og efter rekonvalescent plasmatransfusion hos patienter vil blive opnået på dag 0, dag 1, dag 3 og dag 7, hvis det er muligt.

Alle inkluderede patienter vil blive randomiseret til at modtage enten standard medicinsk terapi (støttende terapi) med tilfældig donorplasma versus rekonvalescent plasma og standard medicinsk terapi. Klinisk information om alle indskrevne patienter inklusive symptomer ved præsentation, tid til præsentation på hospitalet og udvikling af lungesymptomer vil blive optaget. Detaljerne for komorbide sygdomme målt ved Charlson-indekset for komorbiditet og akut fysiologi og kronisk helbredsevaluering II (APACHE II). Detaljer om tværsnitsbilleddannelse, røntgen af ​​thorax, bakterielle eller svampe co-infektioner og detaljer om antibiotikabehandling vil blive registreret. Udvikling af komplikationer, herunder akut nyreskade, akut koronarsyndrom, myokarditis, akut respiratorisk distress-syndrom og nosokomiel infektion vil blive registreret. Brugen af ​​high-flow oxygen, non-invasiv og invasiv ventilation vil følge standard retningslinjer og vil blive registreret. Detaljerne om antiviral behandling, herunder oral oseltamivir, hydroxychloroquin og brug af intravenøse steroider, vil blive registreret for alle tilmeldte patienter.