Efficacia della terapia al plasma convalescente in pazienti con COVID-19 gravemente malati

Per i donatori:

Le piastre di microtitolazione saranno rivestite durante la notte a 4°C con 4 μg/mL di proteine ​​ricombinanti SARS-CoV-2 RBD (receptor binding domain) (50 μL per pozzetto). Le piastre saranno lavate 3 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente 0.1% vol/vol di Tween-20(PBST) e bloccate con soluzione bloccante (PBS contenente 2% wt/vol latte in polvere senza grassi) per 2 ore a 37° C. Le piastre verranno poi lavate con PBST. I campioni di siero saranno diluiti a 200 volte in PBS come concentrazione iniziale, e diluizioni seriali di siero di 3 volte saranno aggiunte ai pozzetti e incubate a 37 °C per 60 minuti. Dopo 3 lavaggi, 100 μL di soluzione di anticorpi anti-umani di capra coniugati con perossidasi di rafano IgG (per il rilevamento del titolo anticorpale IgG) e IgM (per il rilevamento del titolo anticorpale IgM) saranno aggiunti a ciascuna piastra, rispettivamente, e incubati a 37 °C per 60 minuti. Dopo 5 lavaggi, 100 μL di substrato di tetrametilbenzidina verranno aggiunti a temperatura ambiente al buio. Dopo 15 minuti, la reazione sarà bloccata con una soluzione di a2MH2SO4 (acido solforico). L'assorbanza sarà misurata a 450nm. Tutti i campioni verranno analizzati in triplicato. I titoli IgG saranno determinati mediante diluizione endpoint.

Serum Neutralization Assay Le cellule Vero (104) saranno seminate 24 ore prima dell'infezione in una piastra a 96 pozzetti. Il giorno dell'infezione, le cellule verranno lavate due volte. I campioni di siero dei pazienti saranno incubati a 56 °C per 30 minuti e quindi diluiti 2 volte in terreno di coltura cellulare (terreno di aquila modificato). Aliquote (40 μL) di campioni di siero diluiti (da 2 volte a 2056 volte) verranno aggiunte a 50 μL di terreno di coltura cellulare contenente 50 volte la dose infettiva della coltura tissutale (TCID50) del ceppo virale su una piastra a 96 pozzetti e incubate a 37 °C per 2 ore in CO2 5% vol/vol. La miscela di anticorpi del virus verrà aggiunta alle cellule in piastre da 96 pozzetti e le piastre saranno incubate a 37 °C con un esame microscopico per l'effetto citopatico dopo 5 giorni di incubazione. La più alta diluizione del siero che ha mostrato attività di inibizione di SARS-CoV-2 sarà registrata come titolo anticorpale neutralizzante. I saggi saranno eseguiti in triplicato con campioni di controllo negativi di volontari sani.

Per i destinatari:

Il siero di ciascun ricevente sarà ottenuto e il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) e i titoli anticorpali neutralizzanti saranno testati un giorno prima della trasfusione di plasma convalescente. Le modifiche del titolo di IgG specifiche del dominio legante il recettore e dei titoli di anticorpi neutralizzanti prima e dopo la trasfusione di plasma convalescente nei pazienti saranno ottenute il giorno 0, il giorno 1, il giorno 3 e il giorno 7. se possibile.

Tutti i pazienti inclusi sarebbero stati randomizzati per ricevere una terapia medica standard (terapia di supporto) con plasma di donatore casuale rispetto a plasma di convalescente e terapia medica standard Le informazioni cliniche di tutti i pazienti arruolati, compresi i sintomi alla presentazione, il tempo alla presentazione in ospedale e lo sviluppo dei sintomi polmonari sarebbero essere registrato. I dettagli delle malattie in comorbidità misurate dall'indice di comorbidità di Charlson e dalla fisiologia acuta e dalla valutazione della salute cronica II (APACHE II). Verrebbero registrati dettagli di imaging trasversale, radiografia del torace, co-infezioni batteriche o fungine e dettagli del trattamento antibiotico. Verrà registrato lo sviluppo di complicanze tra cui danno renale acuto, sindrome coronarica acuta, miocardite, sindrome da distress respiratorio acuto e infezione nosocomiale. L'uso di ossigeno ad alto flusso, ventilazione non invasiva e invasiva seguirà le linee guida standard e verrà registrato. I dettagli del trattamento antivirale inclusi oseltamivir orale, idrossiclorochina e uso di steroidi per via endovenosa saranno registrati per tutti i pazienti arruolati.