Werkzaamheid van herstellende plasmatherapie bij ernstig zieke COVID-19-patiënten

Voor donateurs:

Microtiterplaten worden een nacht bij 4 °C gecoat met 4 μg/ml recombinant SARS-CoV-2 RBD-eiwitten (receptorbindend domein) (50 μl per putje). De platen worden 3 keer gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,1% vol/vol Tween-20 (PBST) en geblokkeerd met blokkeeroplossing (PBS met 2% wt/vol magere droge melk) gedurende 2 uur bij 37°C. C. De platen worden vervolgens gewassen met PBST. De serummonsters worden tot 200-voudig verdund in PBS als beginconcentratie, en seriële 3-voudige verdunningen van serum worden aan de putjes toegevoegd en gedurende 60 minuten bij 37 °C geïncubeerd. Na 3 wasbeurten wordt 100 μL mierikswortelperoxidase-geconjugeerde anti-humaan IgG-antilichaamoplossing van geiten (voor IgG-antilichaamtiterdetectie) en IgM-antilichaamtiter (voor IgM-antilichaamtiterdetectie) antilichaamoplossing aan respectievelijk elke plaat toegevoegd en geïncubeerd bij 37 °C gedurende 60 minuten. Na 5 wasbeurten wordt 100 μL tetramethylbenzidinesubstraat toegevoegd bij kamertemperatuur in het donker. Na 15 minuten wordt de reactie gestopt met een 2MH2SO4-oplossing (zwavelzuur). De absorptie wordt gemeten bij 450nm. Alle monsters worden in drievoud uitgevoerd. De IgG-titers zullen worden bepaald door eindpuntverdunning.

Serum Neutralization Assay Vero-cellen (104) worden 24 uur vóór de infectie in een plaat met 96 putjes gezaaid. Op de dag van infectie worden de cellen twee keer gewassen. Serummonsters van patiënten worden gedurende 30 minuten bij 56 °C geïncubeerd en vervolgens tweevoudig verdund in celkweekmedium (gemodificeerd adelaarsmedium). Aliquots (40 μl) van verdunde serummonsters (van 2-voudig tot 2056-voudig) worden toegevoegd aan 50 μl celkweekmedium met 50 keer de weefselkweek infectieuze dosis (TCID50) van de virusstam op een plaat met 96 putjes en geïncubeerd bij 37 °C gedurende 2 uur in CO2 5% vol/vol. Een mix van virusantilichamen zal worden toegevoegd aan cellen in platen met 96 putjes en de platen zullen worden geïncubeerd bij 37 °C met een microscopisch onderzoek naar cytopathisch effect na een incubatie van 5 dagen. De hoogste verdunning van serum die remmingsactiviteit van SARS-CoV-2 vertoonde, wordt geregistreerd als de neutraliserende antilichaamtiter. Assays zullen in drievoud worden uitgevoerd met negatieve controlemonsters van gezonde vrijwilligers.

Voor ontvangers:

Het serum van elke ontvanger zal worden verkregen en enzym-gekoppelde immunosorbent assay (ELISA) en neutraliserende antilichaamtiters zullen één dag voorafgaand aan de herstellende plasmatransfusie worden getest. Veranderingen van receptorbindingsdomeinspecifieke IgG-titer en neutraliserende antilichaamtiters voor en na herstellende plasmatransfusie bij patiënten worden, indien mogelijk, verkregen op dag 0, dag 1, dag 3 en dag 7.

Alle geïncludeerde patiënten zouden worden gerandomiseerd om standaard medische therapie (ondersteunende therapie) te krijgen met willekeurig donorplasma versus herstellend plasma en standaard medische therapie. worden opgenomen. De details van comorbide ziekten zoals gemeten door de Charlson-index van comorbiditeit en acute fysiologie en chronische gezondheidsevaluatie II (APACHE II). Details van dwarsdoorsnedebeeldvorming, thoraxfoto's, bacteriële of schimmelco-infecties en details van antibiotische behandeling zouden worden vastgelegd. De ontwikkeling van complicaties, waaronder acuut nierletsel, acuut coronair syndroom, myocarditis, acute respiratory distress syndrome en nosocomiale infectie zullen worden geregistreerd. Het gebruik van high-flow zuurstof, niet-invasieve en invasieve beademing volgt de standaardrichtlijnen en wordt geregistreerd. De details van de antivirale behandeling, waaronder oraal oseltamivir, hydroxychloroquine en het gebruik van intraveneuze steroïden, zullen worden geregistreerd voor alle ingeschreven patiënten.