Eficácia da terapia com plasma convalescente em pacientes gravemente doentes com COVID-19

Para Doadores:

As placas de microtitulação serão revestidas durante a noite a 4°C com proteínas recombinantes SARS-CoV-2 RBD (domínio de ligação ao receptor) de 4 μg/mL (50 μL por poço). As placas serão lavadas 3 vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,1% vol/vol Tween-20(PBST) e bloqueadas com solução de bloqueio (PBS contendo 2% p/vol leite em pó desnatado) por 2 horas a 37° C. As placas serão então lavadas com PBST. As amostras de soro serão diluídas 200 vezes em PBS como concentração inicial, e diluições seriadas de 3 vezes de soro serão adicionadas aos poços e incubadas a 37 °C por 60 minutos. Após 3 lavagens, 100 μL de solução de anticorpos de cabra anti-humanos IgG (para detecção de título de anticorpo IgG) e IgM (para detecção de título de anticorpo IgM) conjugados com peroxidase de rábano silvestre serão adicionados a cada placa, respectivamente, e incubados a 37 °C por 60 minutos. Após 5 lavagens, 100 μL de substrato tetrametilbenzidina serão adicionados à temperatura ambiente no escuro. Após 15 minutos, a reação será interrompida com solução de 2MH2SO4 (ácido sulfúrico). A absorbância será medida a 450nm. Todas as amostras serão executadas em triplicado. Os títulos de IgG serão determinados pela diluição do ponto final.

Ensaio de neutralização sérica As células Vero (104) serão semeadas 24 horas antes da infecção em uma placa de 96 poços. No dia da infecção, as células serão lavadas duas vezes. As amostras de soro dos pacientes serão incubadas a 56 °C por 30 minutos e depois diluídas 2 vezes em meio de cultura celular (meio Eagle modificado). Alíquotas (40 μL) de amostras de soro diluídas (de 2 a 2.056 vezes) serão adicionadas a 50 μL de meio de cultura celular contendo 50 vezes a dose infectante de cultura de tecidos (TCID50) da cepa do vírus em uma placa de 96 poços e incubado a 37 °C por 2 horas em CO2 5% vol/vol. A mistura de anticorpos virais será adicionada às células em placas de 96 poços e as placas serão incubadas a 37 °C com um exame microscópico para efeito citopático após 5 dias de incubação. A maior diluição do soro que apresentou atividade de inibição do SARS-CoV-2 será registrada como o título de anticorpo neutralizante. Os ensaios serão realizados em triplicata com amostras de controle negativo de voluntários saudáveis.

Para destinatários:

O soro de cada receptor será obtido e o ensaio imunoenzimático (ELISA) e os títulos de anticorpos neutralizantes serão testados um dia antes da transfusão de plasma convalescente. As alterações do título de IgG específica do domínio de ligação ao receptor e dos títulos de anticorpos neutralizantes antes e depois da transfusão de plasma convalescente em pacientes serão obtidas no dia 0, dia 1, dia 3 e dia 7, se possível.

Todos os pacientes incluídos seriam randomizados para receber terapia médica padrão (terapia de suporte) com plasma de doador aleatório versus plasma convalescente e terapia médica padrão Informações clínicas de todos os pacientes incluídos, incluindo sintomas na apresentação, tempo de apresentação ao hospital e desenvolvimento de sintomas pulmonares ser gravado. Os detalhes de doenças comórbidas conforme medidos pelo índice de Charlson de comorbidade e Fisiologia Aguda e Avaliação de Saúde Crônica II (APACHE II). Detalhes de imagens transversais, radiografia de tórax, co-infecções bacterianas ou fúngicas e detalhes do tratamento com antibióticos seriam registrados. O desenvolvimento de complicações, incluindo lesão renal aguda, síndrome coronariana aguda, miocardite, síndrome do desconforto respiratório agudo e infecção nosocomial, será registrado. O uso de oxigênio de alto fluxo, ventilação não invasiva e invasiva seguirá as diretrizes padrão e será registrado. Os detalhes do tratamento antiviral, incluindo oseltamivir oral, hidroxicloroquina e uso de esteróides intravenosos, serão registrados para todos os pacientes inscritos.