Wirksamkeit der Rekonvaleszenz-Plasmatherapie bei schwerkranken COVID-19-Patienten

Für Spender:

Mikrotiterplatten werden über Nacht bei 4 °C mit 4 μg/ml rekombinanter SARS-CoV-2-RBD-Proteine ​​(Rezeptorbindungsdomäne) (50 μl pro Vertiefung) beschichtet. Die Platten werden dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), die 0,1 % Vol./Vol. Tween-20 (PBST) enthält, gewaschen und mit Blockierungslösung (PBS, die 2 % Gew./Vol. fettfreie Trockenmilch enthält) für 2 Stunden bei 37° blockiert C. Die Platten werden dann mit PBST gewaschen. Die Serumproben werden auf das 200-fache in PBS als Anfangskonzentration verdünnt, und serielle 3-fache Serumverdünnungen werden in die Vertiefungen gegeben und bei 37 °C für 60 Minuten inkubiert. Nach 3 Waschgängen werden 100 μl Meerrettichperoxidase-konjugierte Ziegen-Anti-Human-IgG- (zum Nachweis des IgG-Antikörpertiters) und IgM-Antikörperlösung (zum Nachweis des IgM-Antikörpertiters) zu jeder Platte gegeben und bei 37 °C inkubiert 60 Minuten. Nach 5 Waschgängen werden 100 μL Tetramethylbenzidin-Substrat bei Raumtemperatur im Dunkeln hinzugefügt. Nach 15 Minuten wird die Reaktion mit einer 2MH2SO4-Lösung (Schwefelsäure) gestoppt. Die Extinktion wird bei 450 nm gemessen. Alle Proben werden dreifach ausgeführt. Die IgG-Titer werden durch Endpunktverdünnung bestimmt.

Serumneutralisationsassay Vero-Zellen (104) werden 24 Stunden vor der Infektion in einer Platte mit 96 Vertiefungen ausgesät. Am Tag der Infektion werden die Zellen zweimal gewaschen. Serumproben von Patienten werden bei 56 °C für 30 Minuten inkubiert und dann 2-fach in Zellkulturmedium (modifiziertes Eagle-Medium) verdünnt. Aliquots (40 μl) verdünnter Serumproben (von 2-fach bis 2056-fach) werden zu 50 μl Zellkulturmedium gegeben, das die 50-fache infektiöse Gewebekulturdosis (TCID50) des Virusstamms auf einer 96-Well-Platte enthält und inkubiert bei 37 °C für 2 Stunden in CO2 5 % vol/vol. Virus-Antikörper-Mix wird zu Zellen in 96-Well-Platten gegeben und die Platten werden bei 37 °C mit einer mikroskopischen Untersuchung auf zytopathische Wirkung nach 5-tägiger Inkubation inkubiert. Die höchste Serumverdünnung, die eine Hemmaktivität von SARS-CoV-2 zeigte, wird als neutralisierender Antikörpertiter aufgezeichnet. Die Assays werden dreifach mit negativen Kontrollproben von gesunden Freiwilligen durchgeführt.

Für Empfänger:

Das Serum jedes Empfängers wird entnommen und ein Tag vor der Rekonvaleszenten-Plasmatransfusion werden ein ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) und neutralisierende Antikörpertiter getestet. Änderungen der rezeptorbindungsdomänenspezifischen IgG-Titer und Titer neutralisierender Antikörper vor und nach Rekonvaleszenten-Plasmatransfusionen bei Patienten werden nach Möglichkeit an Tag 0, Tag 1, Tag 3 und Tag 7 ermittelt.

Alle eingeschlossenen Patienten würden randomisiert, um entweder eine medizinische Standardtherapie (unterstützende Therapie) mit Plasma von zufälligen Spendern oder Rekonvaleszentenplasma und medizinische Standardtherapie zu erhalten aufgezeichnet werden. Die Einzelheiten komorbider Erkrankungen, gemessen anhand des Charlson-Index für Komorbidität und Bewertung der akuten Physiologie und chronischen Gesundheit II (APACHE II). Details zu Querschnittsbildgebung, Thoraxröntgen, bakteriellen oder Pilz-Koinfektionen und Details zur Antibiotikabehandlung würden aufgezeichnet. Die Entwicklung von Komplikationen einschließlich akuter Nierenschädigung, akutem Koronarsyndrom, Myokarditis, akutem Atemnotsyndrom und nosokomialer Infektion wird aufgezeichnet. Die Verwendung von High-Flow-Sauerstoff, nicht-invasiver und invasiver Beatmung folgt den Standardrichtlinien und wird aufgezeichnet. Die Details der antiviralen Behandlung, einschließlich oralem Oseltamivir, Hydroxychloroquin und der Verwendung von intravenösen Steroiden, werden für alle eingeschriebenen Patienten aufgezeichnet.