Skuteczność terapii osoczem rekonwalescencyjnym u ciężko chorych pacjentów z COVID-19

Dla Darczyńców:

Płytki do mikromiareczkowania będą powlekane przez noc w temperaturze 4°C 4 μg/ml rekombinowanych białek SARS-CoV-2 RBD (domena wiążąca receptor) (50 μl na studzienkę). Płytki zostaną przemyte 3 razy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą 0,1% obj./obj. Tween-20(PBST) i zablokowane roztworem blokującym (PBS zawierający 2% wag./obj. C. Płytki zostaną następnie przemyte PBST. Próbki surowicy zostaną rozcieńczone 200-krotnie w PBS jako stężenie początkowe, a seryjne 3-krotne rozcieńczenia surowicy zostaną dodane do studzienek i inkubowane w temperaturze 37°C przez 60 minut. Po 3 płukaniach do każdej płytki zostanie dodane odpowiednio 100 μl roztworu kozich przeciwciał IgG skoniugowanych z peroksydazą chrzanową (do wykrywania miana przeciwciał IgG) i IgM (do wykrywania miana przeciwciał IgM) i inkubowane w temperaturze 37°C przez 60 minut. Po 5 płukaniach dodaje się 100 μl substratu tetrametylobenzydyny w temperaturze pokojowej w ciemności. Po 15 minutach reakcję zatrzyma się roztworem 2MH2SO4 (kwas siarkowy). Absorbancja będzie mierzona przy 450 nm. Wszystkie próbki będą analizowane w trzech powtórzeniach. Miana IgG zostaną określone przez rozcieńczenie w punkcie końcowym.

Test neutralizacji surowicy Komórki Vero (104) zostaną wysiane 24 godziny przed zakażeniem na 96-dołkowej płytce. W dniu zakażenia komórki zostaną przemyte dwukrotnie. Próbki surowicy od pacjentów będą inkubowane w temperaturze 56°C przez 30 minut, a następnie rozcieńczane 2-krotnie w pożywce do hodowli komórkowych (zmodyfikowane podłoże Eagle'a). Porcje (40 μl) rozcieńczonych próbek surowicy (od 2-krotnie do 2056-krotnie) zostaną dodane do 50 μl pożywki do hodowli komórkowej zawierającej 50-krotność dawki zakaźnej dla hodowli tkankowej (TCID50) szczepu wirusa na 96-dołkowej płytce i inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 godziny w CO2 5% obj./obj. Mieszanka przeciwciał wirusowych zostanie dodana do komórek w 96-dołkowych płytkach i płytki będą inkubowane w temperaturze 37°C z badaniem mikroskopowym pod kątem efektu cytopatycznego po 5-dniowej inkubacji. Najwyższe rozcieńczenie surowicy, które wykazało aktywność hamującą SARS-CoV-2, zostanie zarejestrowane jako miano przeciwciał neutralizujących. Testy zostaną przeprowadzone w trzech powtórzeniach z negatywnymi próbkami kontrolnymi od zdrowych ochotników.

Dla odbiorców:

Od każdego biorcy zostanie pobrana surowica i test immunoenzymatyczny (ELISA) oraz miana przeciwciał neutralizujących zostaną zbadane jeden dzień przed transfuzją osocza rekonwalescentów. Zmiany miana swoistych dla domeny wiążącej receptor IgG i miana przeciwciał neutralizujących przed i po transfuzji osocza rekonwalescentów u pacjentów zostaną uzyskane w dniu 0, dniu 1, dniu 3 i dniu 7. jeśli to możliwe.

Wszyscy włączeni pacjenci zostaliby losowo przydzieleni do grupy otrzymującej standardową terapię medyczną (terapia wspomagająca) z osoczem losowego dawcy w porównaniu z osoczem rekonwalescentów i standardową terapią medyczną. zostać nagrany. Szczegółowe informacje na temat chorób współistniejących mierzone za pomocą wskaźnika współwystępowania Charlsona oraz oceny fizjologii ostrej i oceny stanu zdrowia przewlekłego II (APACHE II). Szczegóły dotyczące obrazowania przekrojowego, prześwietlenia klatki piersiowej, koinfekcji bakteryjnych lub grzybiczych oraz szczegóły leczenia antybiotykami zostaną zapisane. Rejestrowany będzie rozwój powikłań, w tym ostre uszkodzenie nerek, ostry zespół wieńcowy, zapalenie mięśnia sercowego, zespół ostrej niewydolności oddechowej i zakażenie szpitalne. Stosowanie tlenu o wysokim przepływie, wentylacja nieinwazyjna i inwazyjna będzie zgodne ze standardowymi wytycznymi i zostanie odnotowane. Szczegóły leczenia przeciwwirusowego, w tym doustnego oseltamiwiru, hydroksychlorochiny i stosowania dożylnych sterydów, zostaną odnotowane dla wszystkich włączonych pacjentów.