Eficacia de la terapia de plasma convaleciente en pacientes gravemente enfermos con COVID-19

Para Donantes:

Las placas de microtitulación se recubrirán durante la noche a 4 °C con 4 μg/mL de proteínas recombinantes SARS-CoV-2 RBD (dominio de unión al receptor) (50 μL por pocillo). Las placas se lavarán 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga 0,1 % vol/vol de Tween-20 (PBST) y se bloquearán con una solución de bloqueo (PBS que contenga 2 % wt/vol de leche descremada en polvo) durante 2 horas a 37 °C. C. Luego, las placas se lavarán con PBST. Las muestras de suero se diluirán a 200 veces en PBS como concentración inicial, y se agregarán a los pocillos diluciones de suero en serie de 3 veces y se incubarán a 37 °C durante 60 minutos. Después de 3 lavados, se agregarán 100 μL de solución de anticuerpos IgG (para la detección del título de anticuerpos IgG) e IgM (para la detección del título de anticuerpos IgM) de cabra conjugados con peroxidasa de rábano picante a cada placa, respectivamente, y se incubarán a 37 °C durante 60 minutos. Después de 5 lavados, se agregarán 100 μL de sustrato de tetrametilbencidina a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de 15 minutos, la reacción se detendrá con una solución de 2MH2SO4 (ácido sulfúrico). La absorbancia se medirá a 450 nm. Todas las muestras se analizarán por triplicado. Los títulos de IgG se determinarán por dilución de punto final.

Ensayo de neutralización de suero Se sembrarán células Vero (104) 24 horas antes de la infección en una placa de 96 pocillos. El día de la infección, las células se lavarán dos veces. Las muestras de suero de los pacientes se incubarán a 56 °C durante 30 minutos y luego se diluirán al doble en medio de cultivo celular (medio Eagle modificado). Se agregarán alícuotas (40 μL) de muestras de suero diluidas (de 2 a 2056 veces) a 50 μL de medio de cultivo celular que contenga 50 veces la dosis infectiva de cultivo de tejido (TCID50) de la cepa del virus en una placa de 96 pocillos y se incubó a 37 °C durante 2 horas en CO2 al 5 % vol/vol. La mezcla de anticuerpos contra el virus se agregará a las células en placas de 96 pocillos y las placas se incubarán a 37 °C con un examen microscópico del efecto citopático después de 5 días de incubación. La dilución más alta de suero que mostró actividad de inhibición del SARS-CoV-2 se registrará como el título de anticuerpos neutralizantes. Los ensayos se realizarán por triplicado con muestras de control negativo de voluntarios sanos.

Para destinatarios:

Se obtendrá el suero de cada receptor y se analizará el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y los títulos de anticuerpos neutralizantes un día antes de la transfusión de plasma convaleciente. Los cambios en el título de IgG específico del dominio de unión al receptor y los títulos de anticuerpos neutralizantes antes y después de la transfusión de plasma convaleciente en pacientes se obtendrán en el día 0, día 1, día 3 y día 7, si es posible.

Todos los pacientes incluidos serían aleatorizados para recibir terapia médica estándar (terapia de apoyo) con plasma de donante aleatorio versus plasma de convaleciente y terapia médica estándar. ser grabado. Los detalles de las enfermedades comórbidas medidas por el índice de comorbilidad de Charlson y la Evaluación de fisiología aguda y salud crónica II (APACHE II). Se registrarían los detalles de las imágenes transversales, la radiografía de tórax, las coinfecciones bacterianas o fúngicas y los detalles del tratamiento con antibióticos. Se registrará el desarrollo de complicaciones que incluyen lesión renal aguda, síndrome coronario agudo, miocarditis, síndrome de dificultad respiratoria aguda e infección nosocomial. El uso de oxígeno de alto flujo, ventilación no invasiva e invasiva seguirá las pautas estándar y se registrará. Los detalles del tratamiento antiviral, incluido el oseltamivir oral, la hidroxicloroquina y el uso de esteroides intravenosos, se registrarán para todos los pacientes inscritos.