Účinnost rekonvalescentní plazmové terapie u těžce nemocných pacientů s COVID-19

Pro dárce:

Mikrotitrační destičky budou potaženy přes noc při 4 °C 4 μg/ml rekombinantních proteinů SARS-CoV-2 RBD (receptor binding domain) (50 μl na jamku). Destičky se 3krát promyjí fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) obsahujícím 0,1 % obj./obj. Tween-20 (PBST) a blokují se blokovacím roztokem (PBS obsahující 2 % hmotn./obj. odtučněného sušeného mléka) po dobu 2 hodin při 37 °C. C. Destičky se poté promyjí PBST. Vzorky séra budou naředěny na 200násobek do PBS jako počáteční koncentrace a do jamek se přidají sériová trojnásobná ředění séra a inkubují se při 37 °C po dobu 60 minut. Po 3 promytích se do každé destičky přidá 100 μl roztoku kozí anti-lidské IgG protilátky proti lidskému IgG (pro detekci titru protilátek IgG) a IgM (pro detekci titru protilátek IgM) konjugovaného s křenovou peroxidázou a inkubuje se při 37 °C 60 minut. Po 5 promytích se při pokojové teplotě ve tmě přidá 100 μl substrátu tetramethylbenzidinu. Po 15 minutách se reakce zastaví roztokem 2MH2SO4 (kyselina sírová). Absorbance bude měřena při 450 nm. Všechny vzorky budou testovány v triplikátech. Titry IgG budou stanoveny konečným ředěním.

Sérový neutralizační test Vero buňky (104) se naočkují 24 hodin před infekcí na 96jamkovou destičku. V den infekce se buňky dvakrát promyjí. Vzorky séra od pacientů budou inkubovány při 56 °C po dobu 30 minut a poté 2krát naředěny v buněčném kultivačním médiu (modifikované Eagle médium). Alikvoty (40 μl) zředěných vzorků séra (od 2násobku do 2056násobku) se přidají k 50 μl buněčného kultivačního média obsahujícího 50násobek infekční dávky pro tkáňové kultury (TCID50) virového kmene na 96jamkové destičce a inkubována při 37 °C po dobu 2 hodin v CO2 5 % obj./obj. Směs virových protilátek bude přidána k buňkám v 96jamkových destičkách a destičky budou inkubovány při 37 °C s mikroskopickým vyšetřením na cytopatický účinek po 5denní inkubaci. Nejvyšší ředění séra, které vykazovalo inhibiční aktivitu SARS-CoV-2, bude zaznamenáno jako titr neutralizačních protilátek. Testy budou provedeny v triplikátech s negativními kontrolními vzorky od zdravých dobrovolníků.

Pro příjemce:

Od každého příjemce bude odebráno sérum a den před rekonvalescentní transfuzí plazmy bude testován enzymatický imunosorbentní test (ELISA) a titry neutralizačních protilátek. Změny titru IgG specifické pro receptorovou vazebnou doménu a titrů neutralizačních protilátek před a po rekonvalescentní transfuzi plazmy u pacientů budou získány v den 0, den 1, den 3 a den 7, pokud je to možné.

Všichni zahrnutí pacienti by byli randomizováni tak, aby dostávali buď standardní lékařskou terapii (podpůrná terapie) s plazmou od náhodného dárce versus rekonvalescentní plazmou a standardní lékařskou terapií. být zaznamenán. Podrobnosti o komorbidních onemocněních měřených pomocí Charlsonova indexu komorbidity a akutní fyziologie a hodnocení chronického zdraví II (APACHE II). Budou zaznamenány podrobnosti o zobrazení průřezu, rentgenu hrudníku, bakteriálních nebo plísňových koinfekcích a podrobnosti o léčbě antibiotiky. Bude zaznamenán vývoj komplikací včetně akutního poškození ledvin, akutního koronárního syndromu, myokarditidy, syndromu akutní respirační tísně a nozokomiální infekce. Použití kyslíku s vysokým průtokem, neinvazivní a invazivní ventilace se bude řídit standardními pokyny a bude zaznamenáno. Podrobnosti o antivirové léčbě včetně perorálního oseltamiviru, hydroxychlorochinu a použití intravenózních steroidů budou zaznamenány u všech zařazených pacientů.