Effektiviteten av konvalescentplasmaterapi hos svårt sjuka covid-19-patienter

För givare:

Mikrotiterplattor kommer att beläggas över natten vid 4°C med 4 μg/mL rekombinanta SARS-CoV-2 RBD (receptorbindande domän)-proteiner (50 μL per brunn). Plattorna kommer att tvättas 3 gånger med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) innehållande 0,1% vol/vol Tween-20(PBST) och blockeras med blockeringslösning (PBS innehållande 2% vikt/vol fettfri torrmjölk) i 2 timmar vid 37° C. Plattorna tvättas sedan med PBST. Serumproverna kommer att spädas till 200-faldigt i PBS som initial koncentration, och seriella 3-faldiga utspädningar av serum kommer att läggas till brunnarna och inkuberas vid 37 °C i 60 minuter. Efter 3 tvättar kommer 100 μL av pepparrotsperoxidas-konjugerad get-anti-humant IgG (för IgG-antikroppstiterdetektion) och IgM (för IgM-antikroppstiterdetektion) antikroppslösning att tillsättas till varje platta respektive och inkuberas vid 37 °C för 60 minuter. Efter 5 tvättar tillsätts 100 μL tetrametylbensidinsubstrat vid rumstemperatur i mörker. Efter 15 minuter kommer reaktionen att stoppas med en 2MH2SO4-lösning (svavelsyra). Absorbansen kommer att mätas vid 450 nm. Alla prover körs i tre exemplar. IgG-titrarna kommer att bestämmas genom slutpunktsspädning.

Serumneutraliseringsanalys Vero-celler (104) sås 24 timmar före infektionen i en platta med 96 brunnar. På infektionsdagen kommer cellerna att tvättas två gånger. Serumprover från patienter inkuberas vid 56 °C i 30 minuter och späds sedan två gånger i cellodlingsmedium (modifierat örnmedium). Alikvoter (40 μL) av utspädda serumprover (från 2-faldigt till 2056-faldigt) kommer att läggas till 50 μL cellodlingsmedium innehållande 50 gånger den smittsamma vävnadskulturdosen (TCID50) av virusstammen på en 96-brunnars platta och inkuberades vid 37 °C under 2 timmar i CO2 5 % vol/vol. Virusantikroppsblandning kommer att läggas till celler i 96-brunnars plattor och plattor kommer att inkuberas vid 37 °C med en mikroskopisk undersökning för cytopatisk effekt efter 5 dagars inkubation. Den högsta utspädningen av serum som visade hämmande aktivitet av SARS-CoV-2 kommer att registreras som den neutraliserande antikroppstitern. Analyser kommer att utföras i tre exemplar med negativa kontrollprover från friska frivilliga.

För mottagare:

Serumet från varje mottagare kommer att erhållas och enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) och neutraliserande antikroppstitrar kommer att testas en dag före den konvalescenta plasmatransfusionen. Förändringar av receptorbindande domänspecifik IgG-titer och neutraliserande antikroppstitrar före och efter konvalescent plasmatransfusion hos patienter kommer om möjligt att erhållas på dag 0, dag 1, dag 3 och dag 7.

Alla inkluderade patienter skulle randomiseras till att få antingen standardmedicinsk terapi (understödjande terapi) med slumpmässig donatorplasma kontra konvalescent plasma och standardmedicinsk terapi. Klinisk information om alla inskrivna patienter inklusive symtom vid presentation, tid till presentation till sjukhus och utveckling av lungsymtom skulle spelas in. Detaljerna för komorbida sjukdomar mätt med Charlson-index för komorbiditet och akut fysiologi och kronisk hälsoutvärdering II (APACHE II). Detaljer om tvärsnittsavbildning, lungröntgen, bakteriella eller svampsaminfektioner och detaljer om antibiotikabehandling skulle registreras. Utveckling av komplikationer inklusive akut njurskada, akut kranskärlssyndrom, myokardit, akut andnödsyndrom och nosokomial infektion kommer att registreras. Användningen av högflödessyre, icke-invasiv och invasiv ventilation följer standardriktlinjerna och kommer att registreras. Detaljerna för antiviral behandling inklusive oral oseltamivir, hydroxiklorokin och användning av intravenösa steroider kommer att registreras för alla inskrivna patienter.