Survivine et fibuline-3 dans les maladies respiratoires bénignes et malignes

Conception et participants de l'étude L'étude de cohorte prospective actuelle a été menée auprès de 73 patients des deux sexes, atteints de maladies respiratoires bénignes et malignes récemment diagnostiquées, recrutés dans les départements de chirurgie cardio-thoracique et d'oncologie, hôpitaux universitaires de Qena, Université de South Valley, Égypte. Les patients inclus ont été classés en 4 groupes. Le groupe A comprenait 21 patients atteints de cancer du poumon, le groupe B comprenait 21 patients atteints de diverses maladies pulmonaires bénignes, le groupe D comprenait 15 patients atteints de mésothéliome pleural malin (MPM) et le groupe E comprenait 16 patients atteints de diverses maladies pleurales bénignes. De plus, 20 sujets sains appariés selon l'âge et le sexe servent de groupe témoin (groupe C). Les patients souffrant d'insuffisance rénale, d'insuffisance hépatique, d'insuffisance cardiopulmonaire sévère, de coagulopathie ou d'instabilité hémodynamique ont été exclus. L'étude a été approuvée par le comité d'éthique de la faculté de médecine de l'université de South Valley, Qena, Égypte, et elle a été menée conformément à la déclaration de Helsinki. Un consentement écrit éclairé a été obtenu de chaque sujet inclus. La durée de l'étude était de deux ans, du 1er janvier 2017 au 30 décembre 2019.

Collecte des données Un historique complet et des examens cliniques approfondis ont été réalisés pour chaque patient inclus. De plus, des évaluations radiologiques par CXR et CT simples et des examens de laboratoire de routine (lactate déshydrogénase sérique (LDH), protéines totales, albumine, fonctions hépatique et rénale, VS et CBC) ont été effectués. Des biopsies pulmonaires multiples ont été prélevées et envoyées pour examen histopathologique lorsque cela était indiqué. Une thoracentèse a été réalisée pour les cas avec épanchement pleural avéré. L'analyse standard du liquide pleural a été effectuée, y compris : le pH, les tests biochimiques de la plèvre/sérum (LDH, glucose, albumine et adénosine désaminase (ADA), les tests cytologiques et microbiologiques (culture Z-N, L-J) et la numération cellulaire différentielle) et les critères originaux de Light ( rapport liquide pleural/protéines sériques > 0,5, rapport LDH pleural/sérum > 0,6 ou LDH du liquide pleural supérieur aux deux tiers de la limite supérieure de la valeur sérique normale) pour distinguer les épanchements pleuraux exsudatifs des épanchements transsudatifs. Un thoracoscope a été réalisé pour les patients dont la cytologie ou l'analyse du liquide pleural étaient indécises, et plusieurs biopsies pleurales ont été prélevées pour un examen histopathologique. L'épanchement pleural malin a été diagnostiqué si la cytologie du liquide pleural ou les résultats de la biopsie pleurale étaient positifs pour la malignité.

La stadification du MPM a été réalisée à l'aide de van Meerbeeck et al, tandis que celle du cancer du poumon a été évaluée selon Lim et al.

Échantillons sanguins et prélèvements de liquide d'épanchement pleural Cinq ml de sang veineux ont été prélevés sur chaque sujet inclus à l'aide de tubes de gel séparateur de sérum et ont été laissés coaguler à température ambiante pendant 30 minutes, puis centrifugés pendant 15 minutes à 1000 g. Les sérums séparés ont été stockés en aliquotes en utilisant des cryotubes de 1 ml à -80°C pour des dosages biochimiques ultérieurs de la survivine et de la fibuline-3. De plus, 10 ml de liquide pleural des patients inclus ont été centrifugés pendant 15 minutes à 1000 g et stockés dans des aliquotes à l'aide de cryotubes de 1 ml à -80 ° C pour des dosages moléculaires ultérieurs des niveaux d'expression de la survivine et de la fibuline-3 à l'aide d'une analyse Western blot.

Dosages ELISA de l'IGF-I et de la survivine Les déterminations quantitatives de la survivine sérique et de la fibuline-3 ont été réalisées à l'aide de kits de dosage ELISA disponibles dans le commerce fournis par Chongqing Biospes Co., Ltd, Chine avec les numéros de catalogue BYE3519 et BYEK2017 respectivement. Les dosages ont été effectués à l'aide d'un lecteur ELISA de microplaque (EMR 500, USA), selon le protocole de fabrication.

Évaluations par transfert Western des niveaux d'expression de la survivine et de la fibuline-3 Les biopsies pulmonaires et pleurales ont été homogénéisées dans un tampon de lyse RIPA glacé (Sigma-Aldrich, Milan, Italie), contenant 1 % de cocktail d'inhibiteurs de protéase (Cell Signaling Technology, Inc., MA, États-Unis) à l'aide d'un homogénéisateur à rotor-stator Potter-Elvehjem (homogénéisateur en verre/téflon), équipé d'un pilon en téflon et stocké congelé à -70 ° C pour une évaluation ultérieure des expressions de la survivine nucléaire tissulaire et de la fibuline-3 par la technique de transfert Western.

Les protéines de chaque poumon correspondant, homogénats de tissu pleural ou échantillon d'épanchement pleural ont été dénaturées à 95 ° C pendant 5 minutes dans un tampon de Laemmli 2 × suivi de l'ajout de 5% de 2-mercaptoéthanol. L'électrophorèse SDS-PAGE a été réalisée en chargeant 50 µg de protéines par voie à 75 volts à travers un gel de résolution (18 % pour la survivine et 15 % pour la fibuline-3) suivi de 125 volts pendant environ 2 heures et transféré sur une membrane PVDF à l'aide de T-77 Unité de transfert semi-sèche ECL (Amersham BioSciences UK Ltd) pendant 2 heures. L'immunotransfert a été réalisé en incubant la membrane PVDF dans du tampon TBS contenant 0,1 % de Tween et 5 % de lait écrémé pendant une heure à 4 °C, suivi d'une incubation d'une nuit à 4 °C avec un anticorps polyclonal anti-survivine de lapin (Bioss Inc., Massachusetts , USA) et un anticorps polyclonal anti-fibuline-3 de lapin (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA) à une dilution de 1:1500. Après avoir été lavée trois fois avec du tampon TBST, chaque membrane a été incubée pendant 1 heure à température ambiante avec un anticorps secondaire anti-souris de chèvre conjugué à la phosphatase alcaline (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA) à une dilution de 1:5000 . Après avoir été lavé quatre fois dans du TBST, l'anticorps lié à la membrane a été détecté avec un kit de détection de substrat BCIP/NBT disponible dans le commerce (Genemed Biotechnologies, Inc., CA, USA). La charge protéique équivalente pour chaque voie a été confirmée en décapant et re-blottant chaque membrane à 4 ° C contre un anticorps monoclonal anti-β-actine de souris (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA) à une dilution de 1: 5000. L'analyse a été répétée 3 fois pour assurer la reproductibilité des résultats. La quantification a été réalisée à l'aide du logiciel ImageJ et exprimée en densité de bande par rapport à celle de la β-actine.

Analyse statistique La saisie et l'analyse des données ont été effectuées à l'aide de SPSS version 19 (Statistical Package for Social Science). Les données ont été présentées sous forme de nombre, de pourcentage, de moyenne et d'écart type pour les données paramétriques. Le test du chi carré et le test exact de Fisher ont été utilisés pour comparer les variables qualitatives. Un test t indépendant a été utilisé pour comparer les variables quantitatives entre les deux groupes. La corrélation de Pearson a été faite pour mesurer la corrélation entre la variable quantitative. Le programme Medcalc a été utilisé pour calculer la sensibilité, la spécificité, les valeurs prédictives positives et négatives avec le calcul de l'ASC (IC à 95 %). La valeur P était considérée comme statistiquement significative lorsqu'elle était < 0,05.