Survivin a fibulin-3 u benigních a maligních respiračních onemocnění

Návrh studie a účastníci Současná prospektivní kohortová studie byla provedena se 73 pacienty obou pohlaví s nedávno diagnostikovanými benigními a maligními respiračními onemocněními, kteří byli rekrutováni z kardio-hrudního chirurgického a onkologického oddělení, Qena University Hospitals, South Valley University, Egypt. Zařazení pacienti byli rozděleni do 4 skupin. Skupina A zahrnovala 21 pacientů s rakovinou plic, skupina B zahrnovala 21 pacientů s různými benigními plicními chorobami, skupina D zahrnovala 15 pacientů s maligním mezoteliomem pleury (MPM) a skupina E zahrnovala 16 pacientů s různými benigními onemocněními pleury. Kromě toho 20 nepříbuzných zdravých subjektů s odpovídajícím věkem a pohlavím slouží jako kontrolní skupina (skupina C). Pacienti se selháním ledvin, jater, závažným kardiopulmonálním postižením, koagulopatií nebo hemodynamicky nestabilní byli vyloučeni. Studie byla schválena Etickou komisí Lékařské fakulty Univerzity South Valley, Qena, Egypt a byla provedena v souladu s deklarací Helsinki. Od každého zahrnutého subjektu byl získán informovaný písemný souhlas. Studium trvalo dva roky od 1. ledna 2017 do 30. prosince 2019.

Sběr dat U každého zahrnutého pacienta byla provedena úplná anamnéza, důkladná klinická vyšetření. Kromě toho byla provedena radiologická vyšetření pomocí prostého CXR a CT a rutinní laboratorní vyšetření (sérová laktátdehydrogenáza (LDH), celkový protein, albumin, funkce jater a ledvin, ESR a CBC). Bylo odebráno více plicních biopsií a odesláno k histopatologickému vyšetření, pokud je to indikováno. U případů s prokázaným pleurálním výpotkem byla provedena torakocentéza. Byla provedena standardní analýza pleurální tekutiny zahrnující: pH, biochemické testování pleury/séra (LDH, glukóza, albumin a adenosindeamináza (ADA), cytologické a mikrobiologické testování (kultura Z-N, L-J a diferenciální počet buněk) a Lightova původní kritéria ( poměr pleurální tekutiny/sérového proteinu >0,5, poměr pleurální/sérové ​​LDH >0,6 nebo LDH pleurální tekutiny více než dvě třetiny horní hranice normální hodnoty séra) k rozlišení exsudativních a transsudativních pleurálních výpotků. Torakoskop byl proveden u pacientů s nerozhodnou cytologií nebo analýzou pleurální tekutiny a pro histopatologické vyšetření byly odebrány četné biopsie pleury. Maligní pleurální výpotek byl diagnostikován, pokud nálezy cytologie pleurální tekutiny nebo pleurální biopsie byly pozitivní na malignitu.

Stanovení stadia MPM bylo provedeno pomocí van Meerbeecka et al, zatímco staging rakoviny plic byl hodnocen podle Lim et al.

Vzorky krve a odběry tekutiny z pleurálního výpotku Každému zahrnutému subjektu bylo odebráno 5 ml žilní krve pomocí gelových zkumavek se separátorem séra a bylo ponecháno srážet se při teplotě místnosti po dobu 30 minut a poté odstřeďováno po dobu 15 minut při 1000 g. Separovaná séra byla skladována na alikvoty s použitím 1 ml kryozkumavek při -80 °C pro pozdější biochemické testy survivinu a fibulinu-3. Kromě toho bylo 10 ml pleurálních tekutin od zahrnutých pacientů centrifugováno po dobu 15 minut při 1000 g a uloženo do alikvotů s použitím 1 ml kryozkumavek při -80 °C pro pozdější molekulární testy hladin exprese survivinu a fibulinu-3 pomocí analýzy western blot.

Testy ELISA IGF-I a survivinu Kvantitativní stanovení sérového survivinu a fibulinu-3 bylo dosaženo pomocí komerčně dostupných testovacích souprav ELISA dodávaných společností Chongqing Biospes Co., Ltd, Čína s katalogovými čísly BYE3519 a BYEK2017, v daném pořadí. Testy byly prováděny s použitím čtečky mikrodestiček ELISA (EMR 500, USA), podle výrobního protokolu.

Western blot hodnocení hladin exprese survivinu a fibulinu-3 Biopsie plic a pleury byly homogenizovány v ledově chladném RIPA lyzačním pufru (Sigma-Aldrich, Milán, Itálie), obsahujícím 1% koktejl inhibitorů proteázy (Cell Signaling Technology, Inc., MA, USA) za použití Potter-Elvehjem rotor-statorového homogenizátoru (sklo/teflonový homogenizér), opatřeného teflonovou paličkou a skladovaného zmrazeného při -70 °C pro následné hodnocení tkáňových expresí nukleárního survivinu a fibulinu-3 technikou Western blotting.

Proteiny v každém odpovídajícím vzorku plic, pleurální tkáně nebo pleurálního výpotku byly denaturovány při 95 °C po dobu 5 minut v 2x Laemmliho pufru a následně přidán 5% 2-merkaptoethanol. Elektroforéza SDS-PAGE byla dosažena nanesením 50 ug proteinu na dráhu při 75 voltech přes štěpící gel (18 % pro survivin a 15 % pro fibulin-3), následně 125 voltů během přibližně 2 hodin a přenesením na PVDF membránu pomocí T-77 ECL polosuchá přenosová jednotka (Amersham BioSciences UK Ltd) po dobu 2 hodin. Imunoblotování bylo prováděno inkubací PVDF membrány v TBS pufru obsahujícím 0,1 % Tween a 5 % odtučněného mléka po dobu jedné hodiny při 4 °C, následovanou inkubací přes noc při 4 °C s králičí polyklonální protilátkou anti-survivin (Bioss Inc., Massachusetts , USA) a králičí anti-fibulin-3 polyklonální protilátka (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA) v ředění 1:1500. Po trojím promytí pufrem TBST byla každá membrána inkubována po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti s kozí anti-myší sekundární protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA) při ředění 1:5000. . Po čtyřnásobném promytí v TBST byla protilátka vázaná na membránu detekována pomocí komerčně dostupné soupravy pro detekci substrátu BCIP/NBT (Genemed Biotechnologies, Inc., CA, USA). Ekvivalentní nanesení proteinu pro každou dráhu bylo potvrzeno stripováním a opětovným blotováním každé membrány při 4 °C proti myší monoklonální protilátce proti p-aktinu (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA) při ředění 1:5000. Analýza byla opakována 3krát, aby byla zajištěna reprodukovatelnost výsledků. Kvantifikace byla provedena pomocí softwaru ImageJ a vyjádřena jako hustota pásu vzhledem k hustotě p-aktinu.

Statistická analýza Zadávání dat a analýza dat byly provedeny pomocí SPSS verze 19 (Statistical Package for Social Science). Data byla prezentována jako číslo, procento, průměr a standardní odchylka pro parametrická data. K porovnání kvalitativních proměnných byly použity Chí-kvadrát test a Fisherův exaktní test. K porovnání kvantitativních proměnných mezi dvěma skupinami byl použit nezávislý t-test. Pro měření korelace mezi kvantitativní proměnnou byla provedena Pearsonova korelace. Program Medcalc byl použit k výpočtu senzitivity, specificity, pozitivních a negativních prediktivních hodnot s výpočtem AUC (95% CI). P-hodnota byla považována za statisticky významnou, když <0,05.