Survivin och Fibulin-3 vid benigna och maligna luftvägssjukdomar

Studiedesign och deltagare Den aktuella prospektiva kohortstudien har genomförts med 73 patienter av båda könen, med nyligen diagnostiserade benigna och maligna luftvägssjukdomar, rekryterade från kardio-thoraxkirurgiska och onkologiska avdelningar, Qena University Hospitals, South Valley University, Egypten. De inkluderade patienterna kategoriserades i 4 grupper. Grupp A inkluderade 21 patienter med lungcancer, grupp B inkluderade 21 patienter med olika godartade lungsjukdomar, grupp D inkluderade 15 patienter med malignt pleuralt mesoteliom (MPM) och grupp E inkluderade 16 patienter med olika godartade pleurasjukdomar. Dessutom fungerar 20 ålders- och könsmatchade icke-relaterade friska försökspersoner som kontrollgrupp (grupp C). Patienter med njursvikt, leversvikt, allvarlig kardiopulmonell kompromiss, koagulopati eller hemodynamiskt instabila exkluderades. Studien godkändes av den etiska kommittén vid den medicinska fakulteten, South Valley University, Qena, Egypten, och den genomfördes i enlighet med deklarationen av Helsingfors. Informerat skriftligt medgivande har erhållits från varje inkluderat ämne. Studietiden var två år från 1 januari 2017 till 30 december 2019.

Datainsamling Fullständig historia, noggranna kliniska undersökningar gjordes för varje inkluderad patient. Dessutom utfördes radiologiska bedömningar med vanlig CXR och CT, och rutinmässiga laboratorieundersökningar (serumlaktatdehydrogenas (LDH), totalt protein, albumin, lever- och njurfunktioner, ESR och CBC). Flera lungbiopsier togs och skickades för histopatologisk undersökning vid indikation. Thoracentes gjordes för fall med bevisad pleurautgjutning. Standard pleuravätskeanalys gjordes inklusive: pH, biokemisk testning av pleura/serum (LDH, glukos, albumin och adenosindeaminas (ADA), cytologi och mikrobiologiska tester (Z-N, L-J kultur) och differentiellt cellantal) och Lights ursprungliga kriterier ( förhållandet mellan pleuravätska/serumprotein >0,5, förhållandet mellan pleura/serum-LDH >0,6 eller pleuravätska-LDH mer än två tredjedelar av den övre gränsen för normalt serumvärde) för att skilja exsudativ från transudativ pleurautgjutning. Thoracoscope gjordes för patienter med obeslutsam cytologi eller pleuralvätskeanalys, och flera pleurabiopsier togs för histopatologisk undersökning. Den maligna pleurautgjutningen diagnostiserades om pleuralvätskecytologi eller pleuralbiopsi var positiva för malignitet.

Stadieindelning av MPM gjordes med van Meerbeeck et al, medan den för lungcancer bedömdes enligt Lim et al.

Blodprover och samlingar av pleurautgjutning. Fem ml venöst blod togs från varje inkluderad patient med användning av serumseparatorgelrör och fick koagulera vid rumstemperatur i 30 minuter och centrifugerades sedan i 15 minuter vid 1000 g. De separerade serumen lagrades i alikvoter med användning av 1 ml kryorör vid -80°C för senare biokemiska analyser av survivin och fibulin-3. Dessutom centrifugerades 10 ml pleuravätskor från de inkluderade patienterna i 15 minuter vid 1000 g och lagrades i alikvoter med användning av 1 ml kryorör vid -80°C för senare molekylära analyser av survivin- och fibulin-3-expressionsnivåer med hjälp av western blot-analys.

ELISA-analyser av IGF-I och survivin Kvantitativa bestämningar av serumsurvivin och fibulin-3 uppnåddes med användning av kommersiellt tillgängliga ELISA-analyssatser från Chongqing Biospes Co., Ltd, Kina med katalognummer BYE3519 respektive BYEK2017. Analyserna utfördes med användning av ELISA-läsare för mikroplattor (EMR 500, USA), enligt tillverkningsprotokoll.

Western blotting-bedömningar av survivin- och fibulin-3-expressionsnivåer Lung- och pleurabiopsier homogeniserades i iskall RIPA-lysbuffert (Sigma-Aldrich, Milano, Italien), innehållande 1 % proteashämmarecocktail (Cell Signaling Technology, Inc., MA, USA) med användning av Potter-Elvehjem rotor-stator-homogenisator (glas/teflon-homogenisator), utrustad med en teflonstöt och lagrad fryst vid -70 ° C för efterföljande bedömning av vävnadsnukleär survivin och fibulin-3-uttryck med Western blotting-teknik.

Proteiner i varje motsvarande lung-, pleuravävnadshomogenat eller pleurautgjutningsprov denaturerades vid 95 °C under 5 minuter i 2 x Laemmli-buffert följt av tillsats av 5 % 2-merkaptoetanol. SDS-PAGE-elektrofores uppnåddes genom att ladda 50 µg protein per bana vid 75 volt genom resolving gel (18% för survivin och 15% för fibulin-3) följt av 125 volt under cirka 2 timmar och överförd till ett PVDF-membran med T-77 ECL semidry överföringsenhet (Amersham BioSciences UK Ltd) i 2 timmar. Immunoblotting utfördes genom att inkubera PVDF-membranet i TBS-buffert innehållande 0,1 % Tween och 5 % fettfri mjölk under en timme vid 4 °C, följt av inkubation över natten vid 4 °C med polyklonal anti-survivinantikropp från kanin (Bioss Inc., Massachusetts) , USA) och kanin anti-fibulin-3 polyklonal antikropp (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA) vid en utspädning av 1:1500. Efter att ha tvättats tre gånger med TBST-buffert, inkuberades varje membran i 1 timme vid rumstemperatur med en alkaliskt fosfataskonjugerad sekundär get-anti-mus-antikropp (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA) vid en utspädning av 1:5000 . Efter att ha tvättats fyra gånger i TBST detekterades den membranbundna antikroppen med ett kommersiellt tillgängligt BCIP/NBT-substratdetektionskit (Genemed Biotechnologies, Inc., CA, USA). Ekvivalent proteinladdning för varje bana bekräftades genom strippning och re-blotting av varje membran vid 4°C mot mus monoklonal anti-β-aktin-antikropp (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA) vid en utspädning av 1:5000. Analysen upprepades 3 gånger för att säkerställa reproducerbarheten av resultaten. Kvantifiering utfördes med hjälp av ImageJ-mjukvara och uttrycktes som banddensiteten i förhållande till den för β-aktin.

Statistisk analys Datainmatning och dataanalys gjordes med SPSS version 19 (Statistical Package for Social Science). Data presenterades som ett antal, procent, medelvärde och standardavvikelse för parametriska data. Chi-kvadrattest och Fisher exakt test användes för att jämföra kvalitativa variabler. Oberoende t-test användes för att jämföra kvantitativa variabler mellan två grupper. Pearson-korrelation gjordes för att mäta korrelationen mellan kvantitativ variabel. Medcalc-programmet användes för att beräkna sensitivitet, specificitet, positiva och negativa prediktiva värden med beräkning av AUC (95 % CI). P-värdet ansågs vara statistiskt signifikant när <0,05.