Survivin und Fibulin-3 bei gutartigen und bösartigen Atemwegserkrankungen

Studiendesign und Teilnehmer Die aktuelle prospektive Kohortenstudie wurde mit 73 Patienten beiderlei Geschlechts mit kürzlich diagnostizierten gutartigen und bösartigen Atemwegserkrankungen durchgeführt, die aus Abteilungen für Herz-Thorax-Chirurgie und Onkologie der Qena-Universitätskliniken der South Valley University, Ägypten, rekrutiert wurden. Die eingeschlossenen Patienten wurden in 4 Gruppen eingeteilt. Gruppe A umfasste 21 Patienten mit Lungenkrebs, Gruppe B umfasste 21 Patienten mit verschiedenen gutartigen Lungenerkrankungen, Gruppe D umfasste 15 Patienten mit malignem Pleuramesotheliom (MPM) und Gruppe E umfasste 16 Patienten mit verschiedenen gutartigen Pleuraerkrankungen. Darüber hinaus dienen 20 in Alter und Geschlecht übereinstimmende, nicht verwandte gesunde Probanden als Kontrollgruppe (Gruppe C). Patienten mit Nierenversagen, Leberversagen, schwerer kardiopulmonaler Beeinträchtigung, Koagulopathie oder hämodynamischer Instabilität wurden ausgeschlossen. Die Studie wurde von der Ethikkommission der medizinischen Fakultät der South Valley University, Qena, Ägypten, genehmigt und gemäß der Erklärung von durchgeführt Helsinki. Von jedem eingeschlossenen Subjekt wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Die Studiendauer betrug zwei Jahre vom 1. Januar 2017 bis 30. Dezember 2019.

Datenerfassung Für jeden eingeschlossenen Patienten wurden eine vollständige Anamnese und gründliche klinische Untersuchungen durchgeführt. Zusätzlich wurden radiologische Untersuchungen durch einfache CXR und CT sowie routinemäßige Laboruntersuchungen (Serumlaktatdehydrogenase (LDH), Gesamtprotein, Albumin, Leber- und Nierenfunktionen, BSG und Blutbild) durchgeführt. Es wurden mehrere Lungenbiopsien entnommen und bei Bedarf zur histopathologischen Untersuchung eingeschickt. Bei nachgewiesenem Pleuraerguss wurde eine Thorakozentese durchgeführt. Die Standardanalyse der Pleuraflüssigkeit umfasste Folgendes: pH-Wert, biochemische Tests von Pleura/Serum (LDH, Glucose, Albumin und Adenosin-Desaminase (ADA), Zytologie und mikrobiologische Tests (Z-N-, L-J-Kultur) und Differenzialzellzahl) sowie die ursprünglichen Kriterien von Light ( Verhältnis Pleuraflüssigkeit/Serumprotein > 0,5, Verhältnis Pleura/Serum LDH > 0,6 oder Pleuraflüssigkeit LDH mehr als zwei Drittel der Obergrenze des normalen Serumwertes), um exsudative von transsudativen Pleuraergüssen zu unterscheiden. Bei Patienten mit unentschlossener Zytologie oder Pleuraflüssigkeitsanalyse wurde eine Thorakoskopie durchgeführt und es wurden mehrere Pleurabiopsien zur histopathologischen Untersuchung entnommen. Der bösartige Pleuraerguss wurde diagnostiziert, wenn die Pleuraflüssigkeitszytologie oder die Pleurabiopsie positiv auf eine Malignität hinwiesen.

Die Einstufung von MPM erfolgte nach van Meerbeeck et al., während die Einstufung von Lungenkrebs nach Lim et al. erfolgte.

Blutproben und Pleuraerguss-Flüssigkeitssammlungen Fünf ml venöses Blut wurden jedem eingeschlossenen Probanden unter Verwendung von Serum-Trenngelröhrchen entnommen und man ließ es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerinnen und dann 15 Minuten lang bei 1000 g zentrifugieren. Die getrennten Seren wurden in Aliquots unter Verwendung von 1-ml-Kryoröhrchen bei -80 °C für spätere biochemische Tests von Survivin und Fibulin-3 gelagert. Zusätzlich wurden 10 ml Pleuraflüssigkeiten der eingeschlossenen Patienten 15 Minuten lang bei 1000 g zentrifugiert und in Aliquots unter Verwendung von 1-ml-Kryoröhrchen bei -80 °C für spätere molekulare Tests der Survivin- und Fibulin-3-Expressionsniveaus mittels Western-Blot-Analyse gelagert.

ELISA-Tests von IGF-I und Survivin Quantitative Bestimmungen von Serum-Survivin und Fibulin-3 wurden mit kommerziell erhältlichen ELISA-Testkits von Chongqing Biospes Co., Ltd, China, mit den Katalognummern BYE3519 bzw. BYEK2017 durchgeführt. Die Tests wurden mit einem Mikroplatten-ELISA-Lesegerät (EMR 500, USA) gemäß dem Herstellungsprotokoll durchgeführt.

Western-Blot-Bewertungen der Survivin- und Fibulin-3-Expressionsniveaus. Lungen- und Pleurabiopsien wurden in eiskaltem RIPA-Lysepuffer (Sigma-Aldrich, Mailand, Italien) homogenisiert, der 1 % Proteaseinhibitor-Cocktail (Cell Signaling Technology, Inc., MA, USA) unter Verwendung eines Potter-Elvehjem-Rotor-Stator-Homogenisators (Glas/Teflon-Homogenisator), ausgestattet mit einem Teflon-Pistill und gefroren bei -70 °C gelagert für die anschließende Beurteilung der Zellkern-Survivin- und Fibulin-3-Expression mittels Western-Blot-Technik.

Proteine ​​in den entsprechenden Lungen-, Pleuragewebehomogenaten oder Pleuraergussproben wurden 5 Minuten lang bei 95 °C in 2× Laemmli-Puffer denaturiert, gefolgt von der Zugabe von 5 % 2-Mercaptoethanol. Die SDS-PAGE-Elektrophorese wurde erreicht, indem 50 µg Protein pro Spur bei 75 Volt durch ein auflösendes Gel geladen wurden (18 % für Survivin und 15 % für Fibulin-3), gefolgt von 125 Volt über etwa 2 Stunden, und mit T-77 auf eine PVDF-Membran übertragen wurde ECL-Halbtrockentransfereinheit (Amersham BioSciences UK Ltd) für 2 Stunden. Das Immunoblotting wurde durchgeführt, indem die PVDF-Membran in TBS-Puffer, der 0,1 % Tween und 5 % fettfreie Milch enthielt, eine Stunde lang bei 4 °C inkubiert wurde, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 4 °C mit polyklonalem Kaninchen-Anti-Survivin-Antikörper (Bioss Inc., Massachusetts). , USA) und polyklonaler Kaninchen-Anti-Fibulin-3-Antikörper (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA) in einer Verdünnung von 1:1500. Nach dreimaligem Waschen mit TBST-Puffer wurde jede Membran 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit einem alkalischen Phosphatase-konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA) in einer Verdünnung von 1:5000 inkubiert . Nach viermaligem Waschen in TBST wurde der membrangebundene Antikörper mit einem kommerziell erhältlichen BCIP/NBT-Substratnachweiskit (Genemed Biotechnologies, Inc., CA, USA) nachgewiesen. Die äquivalente Proteinbeladung für jede Spur wurde durch Strippen und erneutes Blotten jeder Membran bei 4 °C gegen monoklonalen Maus-Anti-β-Actin-Antikörper (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA) in einer Verdünnung von 1:5000 bestätigt. Die Analyse wurde dreimal wiederholt, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sicherzustellen. Die Quantifizierung wurde mit der ImageJ-Software durchgeführt und als Bandendichte im Verhältnis zu der von β-Actin ausgedrückt.

Statistische Analyse Die Dateneingabe und Datenanalyse erfolgte mit SPSS Version 19 (Statistical Package for Social Science). Die Daten wurden als Zahl, Prozentsatz, Mittelwert und Standardabweichung für parametrische Daten dargestellt. Zum Vergleich qualitativer Variablen wurden der Chi-Quadrat-Test und der exakte Fisher-Test verwendet. Der unabhängige T-Test wurde verwendet, um quantitative Variablen zwischen zwei Gruppen zu vergleichen. Die Pearson-Korrelation wurde durchgeführt, um die Korrelation zwischen quantitativen Variablen zu messen. Das Medcalc-Programm wurde zur Berechnung von Sensitivität, Spezifität sowie positiven und negativen Vorhersagewerten mit Berechnung der AUC (95 %-KI) verwendet. Der P-Wert wurde als statistisch signifikant angesehen, wenn er <0,05 war.