良性および悪性呼吸器疾患におけるサバイビンおよびフィブリン-3

研究デザインと参加者 現在の前向きコホート研究は、エジプトのサウスバレー大学ケナ大学病院の心臓胸部外科および腫瘍科から募集された、最近診断された良性および悪性の呼吸器疾患を持つ男女73人の患者を対象に実施された。 対象となった患者は 4 つのグループに分類されました。 グループ A には肺癌患者 21 名が含まれ、グループ B にはさまざまな良性肺疾患の患者 21 名が含まれ、グループ D には悪性胸膜中皮腫 (MPM) の患者 15 名が含まれ、グループ E にはさまざまな良性胸膜疾患の患者 16 名が含まれていました。 さらに、年齢と性別が一致した血縁のない健康な被験者 20 名が対照群 (グループ C) として機能します。 腎不全、肝不全、重度の心肺不全、凝固障害、または血行力学的に不安定な患者は除外された この研究は、エジプトのケナにあるサウスバレー大学医学部の倫理委員会によって承認され、宣言に従って実施されました。ヘルシンキ。 含まれるすべての被験者から書面によるインフォームドコンセントが得られています。 研究期間は2017年1月1日から2019年12月30日までの2年間でした。

データ収集 対象となるすべての患者について、全病歴と徹底的な臨床検査が行われました。 さらに、単純CXRおよびCTによる放射線学的評価、および日常的な臨床検査（血清乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）、総タンパク質、アルブミン、肝臓および腎臓の機能、ESRおよびCBC）が実施された。 複数の肺生検が行われ、必要に応じて組織病理学的検査に送られました。 胸水貯留が確認された症例に対しては胸腔穿刺が行われた。 以下を含む標準的な胸水分析が行われました: pH、胸膜/血清の生化学検査 (LDH、グルコース、アルブミン、アデノシンデアミナーゼ (ADA)、細胞学および微生物学的検査 (Z-N、L-J 培養)、および分別細胞数)、および Light の独自の基準 (胸水/血清タンパク質比 >0.5、胸水/血清 LDH 比 >0.6、または胸水 LDH が正常血清値の上限の 3 分の 2 を超える場合）、滲出性胸水を浸出性胸水と区別します。 細胞診または胸水分析が判断できない患者に対しては胸腔鏡検査が行われ、病理組織学的検査のために複数の胸膜生検が行われました。 悪性胸水は、胸水細胞診または胸膜生検所見が悪性腫瘍について陽性であった場合に診断される。

MPM の病期分類は van Meerbeeck らを使用して行われ、肺がんの病期分類は Lim らに従って評価されました。

血液サンプルおよび胸水の採取 血清分離ゲルチューブを使用して、対象となったすべての被験者から 5 ml の静脈血を採取し、室温で 30 分間凝固させた後、1000 g で 15 分間遠心分離しました。 分離した血清は、後のサバイビンおよびフィブリン-3の生化学的アッセイのために、1 mlのクライオチューブを使用して-80℃でアリコートに保存した。 さらに、対象患者の胸水 10 ml を 1000 g で 15 分間遠心分離し、ウェスタンブロット分析を使用したサバイビンおよびフィブリン 3 発現レベルの後の分子アッセイのために、-80 ℃で 1 ml クライオチューブを使用してアリコートに保存しました。

IGF-IおよびサバイビンのELISAアッセイ 血清サバイビンおよびフィブリン-3の定量は、中国のChongqing Biospes Co., Ltd.によってそれぞれカタログ番号BYE3519およびBYEK2017で供給される市販のELISAアッセイキットを使用して達成されました。 アッセイは、製造プロトコールに従って、マイクロプレートELISAリーダー(EMR 500、USA)を使用して実施した。

サバイビンおよびフィブリン 3 発現レベルのウェスタンブロッティング評価 肺および胸膜生検を、1% プロテアーゼ阻害剤カクテル (Cell Signaling Technology, Inc.、マサチューセッツ州、米国）は、Potter-Elvehjem ローター ステーター ホモジナイザー (ガラス/テフロン ホモジナイザー) を使用し、テフロン乳棒を取り付け、その後のウエスタンブロッティング技術による組織核サバイビンおよびフィブリン 3 発現の評価のために -70 °C で冷凍保存しました。

対応する肺、胸膜組織ホモジネートまたは胸水サンプルのタンパク質を、2×Laemmli緩衝液中で95℃で5分間変性し、続いて5% 2-メルカプトエタノールを添加した。 SDS-PAGE 電気泳動は、レーンあたり 50 µg のタンパク質を 75 ボルトで分離ゲル (サバイビンについては 18%、フィブリン-3 については 15%) にロードし、その後 125 ボルトで約 2 時間かけて行い、T-77 を使用して PVDF メンブレンに転写しました。 ECLセミドライ転写ユニット(Amersham BioSciences UK Ltd)で2時間。 イムノブロットは、PVDF 膜を 0.1% Tween および 5% 無脂肪乳を含む TBS 緩衝液中で 4℃ で 1 時間インキュベートし、続いてウサギ抗サバイビン ポリクローナル抗体 (Bioss Inc.、マサチューセッツ州) と 4℃ で一晩インキュベートすることによって実施しました。 、米国）およびウサギ抗フィブリン 3 ポリクローナル抗体（Novus Biologicals, LLC、リトルトン、コロラド州、米国）を 1:1500 の希釈で使用しました。 TBST 緩衝液で 3 回洗浄した後、各メンブレンを 1:5000 に希釈したアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス二次抗体 (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA) とともに室温で 1 時間インキュベートしました。 。 TBSTで4回洗浄した後、膜結合抗体を市販のBCIP/NBT基質検出キット(Genemed Biotechnologies, Inc.、カリフォルニア州、米国)で検出した。 各レーンのタンパク質ローディングが同等であることを、各メンブレンをストリッピングし、1:5000 希釈のマウスモノクローナル抗 β-アクチン抗体 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA) に対して 4℃ で再ブロットすることによって確認しました。 結果の再現性を確認するために、分析を 3 回繰り返しました。 ImageJ ソフトウェアを使用して定量化を実行し、β-アクチンのバンド密度に対する相対的なバンド密度として表しました。

統計分析 データ入力とデータ分析は、SPSS バージョン 19 (社会科学のための統計パッケージ) を使用して行われました。 データは、パラメトリック データの数値、パーセンテージ、平均および標準偏差として表示されました。 カイ二乗検定とフィッシャーの直接確率検定を使用して、質的変数を比較しました。 独立した t 検定を使用して、2 つのグループ間の量的変数を比較しました。 ピアソン相関は、量的変数間の相関を測定するために実行されました。 Medcalc プログラムを使用して、AUC (95% CI) を計算して感度、特異度、陽性および陰性の的中率を計算しました。 P 値は、<0.05 の場合に統計的に有意であると見なされます。