Survivin e Fibulin-3 nelle malattie respiratorie benigne e maligne

Disegno dello studio e partecipanti L'attuale studio prospettico di coorte è stato condotto con 73 pazienti di entrambi i sessi, con malattie respiratorie benigne e maligne di recente diagnosi reclutati dai dipartimenti di chirurgia cardiotoracica e oncologia, Qena University Hospitals, South Valley University, Egitto. I pazienti inclusi sono stati classificati in 4 gruppi. Il gruppo A comprendeva 21 pazienti con carcinoma polmonare, il gruppo B comprendeva 21 pazienti con varie malattie polmonari benigne, il gruppo D comprendeva 15 pazienti con mesotelioma pleurico maligno (MPM) e il gruppo E comprendeva 16 pazienti con varie malattie pleuriche benigne. Inoltre, 20 soggetti sani non correlati per età e sesso fungono da gruppo di controllo (gruppo C). Sono stati esclusi i pazienti con insufficienza renale, insufficienza epatica, grave compromissione cardiopolmonare, coagulopatia o emodinamicamente instabili Lo studio è stato approvato dal comitato etico della Facoltà di Medicina, South Valley University, Qena, Egitto, ed è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ogni soggetto incluso. La durata dello studio è stata di due anni dal 1 gennaio 2017 al 30 dicembre 2019.

Raccolta dei dati Per ogni paziente incluso sono stati presi l'anamnesi completa e gli esami clinici approfonditi. Inoltre, sono state eseguite valutazioni radiologiche mediante CXR e TC semplici e indagini di laboratorio di routine (lattato deidrogenasi sierica (LDH), proteine ​​totali, albumina, funzionalità epatica e renale, VES ed emocromo). Sono state prelevate biopsie polmonari multiple e inviate per l'esame istopatologico quando indicato. La toracentesi è stata eseguita per i casi con versamento pleurico accertato. L'analisi standard del liquido pleurico è stata eseguita includendo: pH, test biochimici della pleura/siero (LDH, glucosio, albumina e adenosina deaminasi (ADA), test citologici e microbiologici (coltura Z-N, L-J) e conta cellulare differenziale) e i criteri originali di Light ( rapporto liquido pleurico/proteine ​​sieriche >0,5, rapporto LDH pleurico/siero >0,6 o LDH liquido pleurico superiore a due terzi del limite superiore del normale valore sierico) per discriminare i versamenti pleurici essudativi da quelli transudativi. Il toracoscopio è stato eseguito per i pazienti con citologia indecisa o analisi del liquido pleurico e sono state eseguite più biopsie pleuriche per l'esame istopatologico. Il versamento pleurico maligno è stato diagnosticato se i risultati della citologia del liquido pleurico o della biopsia pleurica erano positivi per malignità.

La stadiazione del MPM è stata effettuata utilizzando van Meerbeeck et al, mentre quella del cancro del polmone è stata valutata secondo Lim et al.

Campioni di sangue e raccolte di liquido di versamento pleurico Cinque ml di sangue venoso sono stati prelevati da ogni soggetto incluso utilizzando provette con gel separatore di siero ed è stato lasciato coagulare a temperatura ambiente per 30 minuti e poi centrifugato per 15 minuti a 1000 g. I sieri separati sono stati conservati in aliquote utilizzando criotubi da 1 ml a -80°C per successivi saggi biochimici di survivina e fibulina-3. Inoltre, 10 ml di fluidi pleurici dei pazienti inclusi sono stati centrifugati per 15 minuti a 1000 g e conservati in aliquote utilizzando criotubi da 1 ml a -80 ° C per successivi saggi molecolari dei livelli di espressione di sopravvivenza e fibulina-3 utilizzando l'analisi western blot.

Dosaggi ELISA di IGF-I e survivin Le determinazioni quantitative di survivin sierico e fibulina-3 sono state ottenute utilizzando kit di test ELISA disponibili in commercio forniti da Chongqing Biospes Co., Ltd, Cina con numeri di catalogo rispettivamente BYE3519 e BYEK2017. I saggi sono stati eseguiti utilizzando un lettore ELISA per micropiastre (EMR 500, USA), secondo il protocollo di produzione.

Valutazioni Western blotting dei livelli di espressione di sopravvivenza e fibulina-3 Biopsie polmonari e pleuriche sono state omogeneizzate in tampone di lisi RIPA ghiacciato (Sigma-Aldrich, Milano, Italia), contenente cocktail di inibitori della proteasi all'1% (Cell Signaling Technology, Inc., MA, USA) utilizzando l'omogeneizzatore rotore-statore Potter-Elvehjem (omogeneizzatore vetro/teflon), dotato di un pestello in teflon e conservato congelato a -70 °C per la successiva valutazione della sopravvivenza nucleare del tessuto e delle espressioni di fibulina-3 mediante tecnica Western blotting.

Le proteine ​​​​in ciascun polmone corrispondente, omogenati di tessuto pleurico o campione di versamento pleurico sono state denaturate a 95 ° C per 5 minuti in tampone 2 × Laemmli seguito dall'aggiunta del 5% di 2-mercaptoetanolo. L'elettroforesi SDS-PAGE è stata ottenuta caricando 50 µg di proteine ​​per corsia a 75 volt attraverso il gel di risoluzione (18% per survivina e 15% per fibulina-3) seguito da 125 volt per circa 2 ore e trasferito su una membrana PVDF usando T-77 Unità di trasferimento semisecco ECL (Amersham BioSciences UK Ltd) per 2 ore. L'immunoblotting è stato eseguito incubando la membrana PVDF in tampone TBS contenente lo 0,1% di Tween e il 5% di latte scremato per un'ora a 4°C, seguita da un'incubazione notturna a 4°C con anticorpo policlonale di coniglio anti-sopravvissuto (Bioss Inc., Massachusetts , USA) e anticorpo policlonale di coniglio anti-fibulina-3 (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA) a una diluizione di 1:1500. Dopo essere stata lavata tre volte con tampone TBST, ciascuna membrana è stata incubata per 1 ora a temperatura ambiente con un anticorpo secondario anti-topo di capra coniugato con fosfatasi alcalina (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA) a una diluizione di 1:5000 . Dopo essere stato lavato quattro volte in TBST, l'anticorpo legato alla membrana è stato rilevato con un kit di rilevamento del substrato BCIP/NBT disponibile in commercio (Genemed Biotechnologies, Inc., CA, USA). Il carico di proteine ​​​​equivalente per ciascuna corsia è stato confermato mediante stripping e re-blotting di ciascuna membrana a 4 ° C contro l'anticorpo monoclonale di topo anti β-actina (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA) a una diluizione di 1: 5000. L'analisi è stata ripetuta 3 volte per garantire la riproducibilità dei risultati. La quantificazione è stata eseguita utilizzando il software ImageJ ed espressa come densità di banda relativa a quella della β-actina.

Analisi statistica L'inserimento e l'analisi dei dati sono stati effettuati utilizzando SPSS versione 19 (Statistical Package for Social Science). I dati sono stati presentati come numero, percentuale, media e deviazione standard per i dati parametrici. Il test del chi-quadrato e il test esatto di Fisher sono stati utilizzati per confrontare le variabili qualitative. Il t-test indipendente è stato utilizzato per confrontare le variabili quantitative tra due gruppi. La correlazione di Pearson è stata eseguita per misurare la correlazione tra variabili quantitative. Il programma Medcalc è stato utilizzato per calcolare la sensibilità, la specificità, i valori predittivi positivi e negativi con il calcolo dell'AUC (IC 95%). Il valore P è stato considerato statisticamente significativo quando <0,05.