Survivin 和 Fibulin-3 在良性和恶性呼吸系统疾病中的作用

研究设计和参与者 目前的前瞻性队列研究已对 73 名男女患者进行，这些患者最近被诊断患有良性和恶性呼吸系统疾病，这些患者来自埃及南谷大学 Qena 大学医院的心胸外科和肿瘤科。 纳入的患者被分为 4 组。 A组包括21例肺癌患者，B组包括21例各种良性肺部疾病患者，D组包括15例恶性胸膜间皮瘤(MPM)患者，E组包括16例各种良性胸膜疾病患者。 另外，20名年龄和性别相匹配的无血缘关系的健康人作为对照组（C组）。 患有肾功能衰竭、肝功能衰竭、严重心肺损害、凝血病或血流动力学不稳定的患者被排除在外 该研究经埃及基纳南谷大学医学院伦理委员会批准，并根据以下声明进行：赫尔辛基。 已从每个包含的主题获得知情的书面同意。 研究时间为2年，自2017年1月1日至2019年12月30日。

数据收集 对每一位纳入的患者都进行了完整的病史、彻底的临床检查。 此外，还进行了普通 CXR 和 CT 的放射学评估，以及常规实验室检查（血清乳酸脱氢酶 (LDH)、总蛋白、白蛋白、肝肾功能、ESR 和 CBC）。 当需要时，取多个肺活组织检查并送去进行组织病理学检查。 对证实有胸腔积液的病例行胸腔穿刺术。 进行的标准胸水分析包括：pH ​​值、胸膜/血清的生化测试（LDH、葡萄糖、白蛋白和腺苷脱氨酶 (ADA)、细胞学和微生物学测试（Z-N、L-J 培养）和分类细胞计数）和 Light 的原始标准（胸水/血清蛋白比值 >0.5，胸水/血清 LDH 比值 >0.6 或胸水 LDH 超过正常血清值上限的三分之二）以区分渗出性和漏出性胸腔积液。 对细胞学或胸水分析结果不明确的患者进行胸腔镜检查，并取多个胸膜活检进行组织病理学检查。 如果胸水细胞学检查或胸膜活检结果为恶性肿瘤阳性，则诊断为恶性胸腔积液。

MPM 的分期使用 van Meerbeeck 等人完成，而肺癌的分期根据 Lim 等人进行评估。

血样和胸腔积液收集 使用血清分离凝胶管从每个包括的受试者中抽取 5 毫升静脉血，并使其在室温下凝结 30 分钟，然后以 1000 克离心 15 分钟。 将分离的血清在-800℃下使用1ml冷冻管储存成等分试样用于随后的存活蛋白和fibulin-3的生化测定。 此外，将来自所包括患者的 10 ml 胸腔积液以 1000g 离心 15 分钟，并在 -800°C 下使用 1 ml 冷冻管储存成等分试样，用于稍后使用蛋白质印迹分析对存活蛋白和 fibulin-3 表达水平进行分子测定。

IGF-I 和存活蛋白的 ELISA 测定血清存活蛋白和 fibulin-3 的定量测定使用由中国重庆 Biospes Co., Ltd 提供的市售 ELISA 测定试剂盒实现，目录号分别为 BYE3519 和 BYEK2017。 根据制造方案，使用微孔板 ELISA 读数器（EMR 500，美国）进行测定。

生存素和 fibulin-3 表达水平的蛋白质印迹评估肺和胸膜活检在冰冷的 RIPA 裂解缓冲液（Sigma-Aldrich，米兰，意大利）中均质化，其中含有 1% 蛋白酶抑制剂混合物（Cell Signaling Technology, Inc., MA, USA) 使用 Potter-Elvehjem 转子-定子匀浆器（玻璃/聚四氟乙烯匀浆器），配备聚四氟乙烯研杵并冷冻储存在 -70 °C，用于随后通过蛋白质印迹技术评估组织核存活蛋白和 fibulin-3 表达。

每个相应的肺、胸膜组织匀浆或胸腔积液样品中的蛋白质在 2× Laemmli 缓冲液中于 95 °C 变性 5 分钟，然后添加 5% 2-巯基乙醇。 SDS-PAGE 电泳是通过在 75 伏电压下通过解析凝胶（18% 用于存活蛋白和 15% 用于 fibulin-3）在每个泳道加载 50 µg 蛋白质，然后在大约 2 小时内进行 125 伏电压并使用 T-77 转移到 PVDF 膜上来实现的ECL 半干转移装置（Amersham BioSciences UK Ltd）2 小时。 通过将 PVDF 膜在含有 0.1% Tween 和 5% 脱脂牛奶的 TBS 缓冲液中在 4°C 下孵育 1 小时，然后在 4°C 下与兔抗存活蛋白多克隆抗体（Bioss Inc.，马萨诸塞州）一起孵育过夜来进行免疫印迹, USA) 和兔抗 fibulin-3 多克隆抗体 (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA)，稀释度为 1:1500。 用 TBST 缓冲液洗涤 3 次后，将每张膜与 1:5000 稀释的碱性磷酸酶偶联山羊抗小鼠二抗（Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA）在室温下孵育 1 小时. 在 TBST 中洗涤四次后，使用市售的 BCIP/NBT 底物检测试剂盒（Genemed Biotechnologies, Inc., CA, USA）检测膜结合抗体。 通过在 4°C 下针对小鼠单克隆抗 β-肌动蛋白抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA）以 1:5000 的稀释度剥离和重新印迹每个膜，确认每个泳道的等效蛋白质负载。 分析重复 3 次以确保结果的可重复性。 使用 ImageJ 软件进行量化，并表示为相对于 β-肌动蛋白的条带密度。

统计分析 数据输入和数据分析使用 SPSS 19 版（社会科学统计包）完成。 数据以数字、百分比、参数数据的平均值和标准差表示。 卡方检验和 Fisher 精确检验用于比较定性变量。 独立 t 检验用于比较两组之间的定量变量。 皮尔逊相关性用于衡量定量变量之间的相关性。 Medcalc 程序用于通过计算 AUC (95% CI) 来计算灵敏度、特异性、阳性和阴性预测值。 当 <0.05 时，P 值被认为具有统计学意义。