Сурвивин и фибулин-3 при доброкачественных и злокачественных заболеваниях органов дыхания

Дизайн исследования и участники Текущее проспективное когортное исследование было проведено с участием 73 пациентов обоего пола с недавно диагностированными доброкачественными и злокачественными респираторными заболеваниями, набранных из отделений сердечно-торакальной хирургии и онкологии больниц Университета Кена, Университета Южной долины, Египет. Включенные пациенты были разделены на 4 группы. В группу А был включен 21 больной раком легкого, в группу Б - 21 больной с различными доброкачественными заболеваниями легких, в группу Д - 15 больных со злокачественной мезотелиомой плевры (ЗМП), в группу Д - 16 больных с различными доброкачественными заболеваниями плевры. Кроме того, контрольной группой (группа С) служат 20 сопоставимых по возрасту и полу здоровых лиц, не являющихся родственниками. Пациенты с почечной недостаточностью, печеночной недостаточностью, тяжелой сердечно-легочной недостаточностью, коагулопатией или нестабильной гемодинамикой были исключены. Исследование было одобрено Этическим комитетом медицинского факультета Университета Южной долины, Кена, Египет, и проводилось в соответствии с Декларацией Хельсинки. Информированное письменное согласие было получено от каждого включенного субъекта. Продолжительность исследования составила два года с 1 января 2017 года по 30 декабря 2019 года.

Сбор данных Полный анамнез, тщательное клиническое обследование каждого включенного пациента. Кроме того, были проведены радиологические оценки с помощью простой рентгенограммы и КТ, а также обычные лабораторные исследования (лактатдегидрогеназа сыворотки (ЛДГ), общий белок, альбумин, функции печени и почек, СОЭ и общий анализ крови). Были взяты множественные биопсии легких и отправлены на гистопатологическое исследование по показаниям. При подтвержденном плевральном выпоте проводят торакоцентез. Был выполнен стандартный анализ плевральной жидкости, включая: рН, биохимическое исследование плевры/сыворотки (ЛДГ, глюкоза, альбумин и аденозиндезаминаза (АДА), цитологическое и микробиологическое тестирование (культура Z-N, L-J) и дифференциальный подсчет клеток) и оригинальные критерии Лайта ( соотношение плевральная жидкость/сывороточный белок >0,5, соотношение плевральной/сывороточной ЛДГ >0,6 или ЛДГ плевральной жидкости более двух третей от верхнего предела нормального значения в сыворотке), чтобы отличить экссудативный плевральный выпот от транссудативного. Торакоскопию выполняли пациентам с неясными результатами цитологического исследования или анализа плевральной жидкости, а для гистопатологического исследования брали множественные плевральные биоптаты. Злокачественный плеврит диагностировали, если цитология плевральной жидкости или результаты биопсии плевры были положительными на злокачественность.

Стадирование MPM проводилось с использованием van Meerbeeck et al., тогда как стадирование рака легких оценивалось в соответствии с Lim et al.

Образцы крови и образцы жидкости из плеврального выпота Пять мл венозной крови брали у каждого включенного субъекта с помощью пробирок с гелевым разделителем сыворотки и оставляли свертываться при комнатной температуре в течение 30 минут, а затем центрифугировали в течение 15 минут при 1000 g. Отделенные сыворотки хранили в аликвотах с использованием криопробирок объемом 1 мл при -80°С для последующих биохимических анализов сурвивина и фибулина-3. Кроме того, 10 мл плевральной жидкости от включенных пациентов центрифугировали в течение 15 минут при 1000 g и хранили в аликвотах с использованием криопробирок объемом 1 мл при -80°C для последующего молекулярного анализа уровней экспрессии сурвивина и фибулина-3 с использованием вестерн-блоттинга.

Анализы ELISA IGF-I и сурвивина Количественные определения сурвивина и фибулина-3 в сыворотке были выполнены с использованием имеющихся в продаже наборов для анализа ELISA, поставляемых Chongqing Biospes Co., Ltd, Китай с каталожными номерами BYE3519 и BYEK2017 соответственно. Анализы проводили с использованием микропланшетного считывателя ELISA (EMR 500, США) в соответствии с протоколом производителя.

Вестерн-блоттинг оценки уровней экспрессии сурвивина и фибулина-3. Биоптаты легких и плевры гомогенизировали в охлажденном льдом буфере для лизиса RIPA (Sigma-Aldrich, Милан, Италия), содержащем 1% смесь ингибиторов протеазы (Cell Signaling Technology, Inc., MA, США) с использованием роторно-статорного гомогенизатора Potter-Elvehjem (гомогенизатор из стекла/тефлона), оснащенного тефлоновым пестиком и хранящегося в замороженном виде при -70 °C для последующей оценки экспрессии тканевого ядерного сурвивина и фибулина-3 методом вестерн-блоттинга.

Белки в каждом соответствующем образце легкого, гомогенатов плевральной ткани или плеврального выпота денатурировали при 95°C в течение 5 минут в 2× буфере Лэммли с последующим добавлением 5% 2-меркаптоэтанола. Электрофорез в SDS-PAGE был достигнут путем загрузки 50 мкг белка на дорожку при 75 вольт через разделяющий гель (18% для сурвивина и 15% для фибулина-3), затем 125 вольт в течение приблизительно 2 часов и переноса на мембрану PVDF с использованием T-77. Установка полусухого переноса ECL (Amersham BioSciences UK Ltd) на 2 часа. Иммуноблоттинг проводили путем инкубации PVDF-мембраны в буфере TBS, содержащем 0,1% твина и 5% обезжиренного молока, в течение одного часа при 4°С с последующей инкубацией в течение ночи при 4°С с кроличьим поликлональным антителом против сурвивина (Bioss Inc., Массачусетс). , США) и кроличьи поликлональные антитела против фибулина-3 (Novus Biologicals, LLC, Литтлтон, Колорадо, США) в разведении 1:1500. После трехкратной промывки буфером TBST каждую мембрану инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с козьим антимышиным вторичным антителом, конъюгированным со щелочной фосфатазой (Novus Biologicals, LLC, Литтлтон, Колорадо, США) в разведении 1:5000. . После четырехкратной промывки в TBST связанное с мембраной антитело определяли с помощью имеющегося в продаже набора для обнаружения субстрата BCIP/NBT (Genemed Biotechnologies, Inc., Калифорния, США). Эквивалентную загрузку белка для каждой дорожки подтверждали путем снятия и повторного блоттинга каждой мембраны при 4°C против мышиного моноклонального антитела против β-актина (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Калифорния, США) в разведении 1:5000. Анализ повторяли 3 раза, чтобы гарантировать воспроизводимость результатов. Количественную оценку проводили с использованием программного обеспечения ImageJ и выражали как плотность полосы относительно плотности β-актина.

Статистический анализ. Ввод и анализ данных проводились с использованием SPSS версии 19 (статистический пакет для социальных наук). Данные были представлены в виде числа, процента, среднего значения и стандартного отклонения для параметрических данных. Критерий хи-квадрат и точный критерий Фишера использовались для сравнения качественных переменных. Независимый t-критерий использовался для сравнения количественных переменных между двумя группами. Корреляция Пирсона была сделана для измерения корреляции между количественными переменными. Программа Medcalc использовалась для расчета чувствительности, специфичности, положительных и отрицательных прогностических значений с расчетом AUC (95% ДИ). Значение P считалось статистически значимым при <0,05.