Survivin en Fibulin-3 bij goedaardige en kwaadaardige aandoeningen van de luchtwegen

Onderzoeksopzet en deelnemers De huidige prospectieve cohortstudie is uitgevoerd met 73 patiënten van beide geslachten, met recent gediagnosticeerde goedaardige en kwaadaardige aandoeningen van de luchtwegen, gerekruteerd uit de afdelingen Cardio-Thoracale Chirurgie en Oncologie, Qena University Hospitals, South Valley University, Egypte. De geïncludeerde patiënten werden ingedeeld in 4 groepen. Groep A omvatte 21 patiënten met longkanker, groep B omvatte 21 patiënten met verschillende goedaardige longziekten, groep D omvatte 15 patiënten met kwaadaardig pleuraal mesothelioom (MPM) en groep E omvatte 16 patiënten met verschillende goedaardige pleurale ziekten. Bovendien dienen 20 niet-verwante gezonde proefpersonen die qua leeftijd en geslacht overeenkomen, als controlegroep (groep C). Patiënten met nierfalen, leverfalen, ernstige cardiopulmonale complicaties, coagulopathie of hemodynamisch onstabiel werden uitgesloten. Het onderzoek werd goedgekeurd door de ethische commissie van de faculteit geneeskunde, South Valley University, Qena, Egypte, en werd uitgevoerd in overeenstemming met de Helsinki. Geïnformeerde schriftelijke toestemming is verkregen van elk opgenomen onderwerp. De studieduur was twee jaar van 1 januari 2017 tot 30 december 2019.

Gegevensverzameling Volledige anamnese, grondige klinische onderzoeken werden uitgevoerd voor elke geïncludeerde patiënt. Daarnaast werden radiologische beoordelingen uitgevoerd door gewone CXR en CT, en routinematige laboratoriumonderzoeken (serumlactaatdehydrogenase (LDH), totaal eiwit, albumine, lever- en nierfuncties, ESR en CBC). Er werden meerdere longbiopten genomen en indien nodig opgestuurd voor histopathologisch onderzoek. Thoracentese werd gedaan voor gevallen met bewezen pleurale effusie. De standaard pleuravochtanalyse werd uitgevoerd, waaronder: pH, biochemisch testen van pleura/serum (LDH, glucose, albumine en adenosinedeaminase (ADA), cytologie en microbiologisch testen (ZN-, LJ-kweek) en differentiële celtelling) en de oorspronkelijke criteria van Light ( verhouding pleuraal vocht/serumeiwit >0,5, verhouding pleuraal/serum LDH >0,6 of pleuraal vocht LDH meer dan tweederde van de bovengrens van de normale serumwaarde) om onderscheid te maken tussen exsudatieve en transsudatieve pleurale effusies. Thoracoscope werd gedaan voor patiënten met besluiteloze cytologie of pleurale vloeistofanalyse, en er werden meerdere pleurale biopsieën genomen voor histopathologisch onderzoek. De kwaadaardige pleurale effusie werd gediagnosticeerd als de bevindingen van pleurale vloeistofcytologie of pleurale biopsie positief waren voor maligniteit.

Stadiëring van MPM werd gedaan met behulp van van Meerbeeck et al, terwijl die van longkanker werd beoordeeld volgens Lim et al.

Bloedmonsters en verzamelingen van pleurale effusievloeistof. Vijf ml veneus bloed werd onttrokken aan elke betrokken proefpersoon met behulp van serumseparator-gelbuizen en men liet deze 30 minuten stollen bij kamertemperatuur en werd vervolgens gedurende 15 minuten gecentrifugeerd bij 1000 g. De gescheiden sera werden in aliquots bewaard met behulp van cryobuisjes van 1 ml bij -80°C voor latere biochemische assays van survivine en fibuline-3. Bovendien werd 10 ml pleurale vloeistof van de geïncludeerde patiënten gedurende 15 minuten bij 1000 g gecentrifugeerd en in aliquots bewaard met behulp van cryobuisjes van 1 ml bij -80°C voor latere moleculaire assays van survivine- en fibuline-3-expressieniveaus met behulp van Western-blotanalyse.

ELISA-assays van IGF-I en survivine Kwantitatieve bepalingen van serumsurvivine en fibuline-3 werden uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgbare ELISA-assaykits geleverd door Chongqing Biospes Co., Ltd, China met respectievelijk catalogusnummers BYE3519 en BYEK2017. De assays werden uitgevoerd met behulp van een microplaat-ELISA-lezer (EMR 500, VS), volgens het fabricageprotocol.

Western-blotting-beoordelingen van survivine- en fibuline-3-expressieniveaus Long- en pleurale biopsieën werden gehomogeniseerd in ijskoude RIPA-lysisbuffer (Sigma-Aldrich, Milaan, Italië), met 1% proteaseremmercocktail (Cell Signaling Technology, Inc., MA, VS) met behulp van Potter-Elvehjem rotor-stator homogenisator (glas/teflon homogenisator), uitgerust met een teflonstamper en ingevroren bewaard bij -70 °C voor latere beoordeling van weefsel nucleaire survivin en fibuline-3 expressies door Western blotting techniek.

Eiwitten in elk corresponderend long-, pleuraal weefselhomogenaat of pleurale effusiemonster werden gedurende 5 minuten bij 95 ° C gedenatureerd in 2 x Laemmli-buffer gevolgd door toevoeging van 5% 2-mercapto-ethanol. SDS-PAGE-elektroforese werd bereikt door 50 μg eiwit per baan bij 75 volt te laden door oplossende gel (18% voor survivin en 15% voor fibuline-3) gevolgd door 125 volt gedurende ongeveer 2 uur en overgebracht naar een PVDF-membraan met behulp van T-77 ECL halfdroge transfereenheid (Amersham BioSciences UK Ltd) gedurende 2 uur. Immunoblotting werd uitgevoerd door het PVDF-membraan te incuberen in TBS-buffer met 0,1% Tween en 5% magere melk gedurende één uur bij 4°C, gevolgd door een nachtelijke incubatie bij 4°C met anti-survivin polyklonaal antilichaam van konijn (Bioss Inc., Massachusetts , VS) en anti-fibuline-3 polyklonaal antilichaam van konijn (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, VS) in een verdunning van 1:1500. Na drie keer te zijn gewassen met TBST-buffer, werd elk membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met een alkalisch fosfatase-geconjugeerd secundair geiten-antimuis-antilichaam (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, VS) in een verdunning van 1:5000. . Na vier keer te zijn gewassen in TBST, werd het membraangebonden antilichaam gedetecteerd met een in de handel verkrijgbare BCIP / NBT-substraatdetectiekit (Genemed Biotechnologies, Inc., CA, VS). Equivalente eiwitbelading voor elke baan werd bevestigd door elk membraan bij 4 ° C te strippen en opnieuw te blotten tegen monoklonaal anti-p-actine-antilichaam van muis (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, VS) bij een verdunning van 1: 5000. De analyse werd 3 keer herhaald om de reproduceerbaarheid van de resultaten te verzekeren. Kwantificering werd uitgevoerd met behulp van ImageJ-software en uitgedrukt als de banddichtheid ten opzichte van die van β-actine.

Statistische analyse Data-invoer en data-analyse werden uitgevoerd met behulp van SPSS versie 19 (Statistical Package for Social Science). Gegevens werden gepresenteerd als een getal, percentage, het gemiddelde en de standaarddeviatie voor parametrische gegevens. Chi-kwadraattoets en Fisher exact-toets werden gebruikt om kwalitatieve variabelen te vergelijken. Onafhankelijke t-test werd gebruikt om kwantitatieve variabelen tussen twee groepen te vergelijken. Pearson-correlatie werd uitgevoerd om de correlatie tussen kwantitatieve variabelen te meten. Het Medcalc-programma werd gebruikt om de sensitiviteit, specificiteit, positieve en negatieve voorspellende waarden te berekenen met berekening van de AUC (95% BI). P-waarde werd als statistisch significant beschouwd wanneer <0,05.