Survivin og Fibulin-3 ved benigne og ondartede luftvejssygdomme

Undersøgelsesdesign og deltagere Det nuværende prospektive kohortestudie er blevet udført med 73 patienter af begge køn, med nyligt diagnosticerede godartede og ondartede luftvejssygdomme, rekrutteret fra Cardio-Thorax Surgery and Oncology Departments, Qena University Hospitals, South Valley University, Egypten. De inkluderede patienter blev kategoriseret i 4 grupper. Gruppe A inkluderede 21 patienter med lungecancer, gruppe B inkluderede 21 patienter med forskellige godartede lungesygdomme, gruppe D omfattede 15 patienter med malignt pleuralt mesotheliom (MPM), og gruppe E inkluderede 16 patienter med forskellige godartede pleurasygdomme. Derudover tjener 20 alders- og kønsmatchede ikke-beslægtede raske forsøgspersoner som kontrolgruppe (gruppe C). Patienter med nyresvigt, leversvigt, alvorligt kardiopulmonært kompromittering, koagulopati eller hæmodynamisk ustabile blev udelukket. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité på det medicinske fakultet, South Valley University, Qena, Egypten, og den blev udført i overensstemmelse med erklæringen om Helsinki. Der er indhentet informeret skriftligt samtykke fra hvert inkluderet emne. Studiets varighed var to år fra 1. januar 2017 til 30. december 2019.

Dataindsamling Fuld historie, grundige kliniske undersøgelser blev taget for hver inkluderet patient. Derudover blev der udført radiologiske vurderinger ved almindelig CXR og CT og rutinemæssige laboratorieundersøgelser (serumlactatdehydrogenase (LDH), totalprotein, albumin, lever- og nyrefunktioner, ESR og CBC). Flere lungebiopsier blev taget og sendt til histopatologisk undersøgelse, når det var indiceret. Thoracentese blev udført for tilfælde med påvist pleural effusion. Standard pleuravæskeanalysen blev udført, herunder: pH, biokemisk test af pleura/serum (LDH, glucose, albumin og adenosindeaminase (ADA), cytologi og mikrobiologiske test (Z-N, L-J kultur) og differentielt celletal) og Lights oprindelige kriterier ( forholdet mellem pleuralvæske/serumprotein >0,5, forholdet mellem pleura/serum-LDH >0,6 eller pleuralvæske-LDH mere end to tredjedele af den øvre grænse for normal serumværdi) for at skelne ekssudativ fra transudative pleurale effusioner. Thoracoscope blev udført for patienter med ubeslutsom cytologi eller pleuralvæskeanalyse, og flere pleurabiopsier blev taget til histopatologisk undersøgelse. Den maligne pleurale effusion blev diagnosticeret, hvis pleuralvæskecytologi eller pleurabiopsifund var positive for malignitet.

Stadieinddeling af MPM blev udført ved hjælp af van Meerbeeck et al., mens den for lungekræft blev vurderet ifølge Lim et al.

Blodprøver og opsamlinger af pleuraeffusionsvæske. Fem ml venøst ​​blod blev udtaget fra hvert inkluderet individ under anvendelse af serumseparatorgelrør og fik lov til at størkne ved stuetemperatur i 30 minutter og derefter centrifugeret i 15 minutter ved 1000 g. De adskilte sera blev opbevaret i aliquoter under anvendelse af 1 ml kryorør ved -80°C til senere biokemiske assays af survivin og fibulin-3. Derudover blev 10 ml pleuralvæsker fra de inkluderede patienter centrifugeret i 15 minutter ved 1000 g og opbevaret i alikvoter under anvendelse af 1 ml kryorør ved -80°C til senere molekylære assays af survivin- og fibulin-3-ekspressionsniveauer under anvendelse af western blot-analyse.

ELISA-assays af IGF-I og survivin Kvantitative bestemmelser af serum-survivin og fibulin-3 blev opnået ved hjælp af kommercielt tilgængelige ELISA-assay-sæt leveret af Chongqing Biospes Co., Ltd, Kina med henholdsvis katalognumre BYE3519 og BYEK2017. Assayene blev udført under anvendelse af mikroplade-ELISA-læser (EMR 500, USA) i henhold til fremstillingsprotokol.

Western blotting-vurderinger af survivin- og fibulin-3-ekspressionsniveauer Lunge- og pleurabiopsier blev homogeniseret i iskold RIPA-lysebuffer (Sigma-Aldrich, Milano, Italien), indeholdende 1% proteasehæmmercocktail (Cell Signaling Technology, Inc., MA, USA) ved hjælp af Potter-Elvehjem rotor-stator homogenisator (glas/teflon homogenisator), udstyret med en teflon støder og opbevaret frosset ved -70 °C til efterfølgende vurdering af vævsnuklear survivin og fibulin-3 udtryk ved Western blotting-teknik.

Proteiner i hver tilsvarende lunge-, pleuravævshomogenat eller pleuraeffusionsprøve blev denatureret ved 95 °C i 5 minutter i 2 x Laemmli-buffer efterfulgt af tilsætning af 5 % 2-mercaptoethanol. SDS-PAGE-elektroforese blev opnået ved at fylde 50 µg protein pr. bane ved 75 volt gennem resolverende gel (18 % for survivin og 15 % for fibulin-3) efterfulgt af 125 volt i løbet af ca. 2 timer og overført til en PVDF-membran ved hjælp af T-77 ECL semidry transfer enhed (Amersham BioSciences UK Ltd) i 2 timer. Immunblotting blev udført ved at inkubere PVDF-membranen i TBS-buffer indeholdende 0,1 % Tween og 5 % fedtfri mælk i en time ved 4 °C, efterfulgt af inkubation natten over ved 4 °C med kanin-anti-survivin polyklonalt antistof (Bioss Inc., Massachusetts , USA) og kanin-anti-fibulin-3 polyklonalt antistof (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA) i en fortynding på 1:1500. Efter at være blevet vasket tre gange med TBST-buffer, blev hver membran inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med et alkalisk phosphatase-konjugeret ged-anti-mus sekundært antistof (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA) i en fortynding på 1:5000 . Efter at være blevet vasket fire gange i TBST, blev det membranbundne antistof påvist med et kommercielt tilgængeligt BCIP/NBT-substratdetektionskit (Genemed Biotechnologies, Inc., CA, USA). Ækvivalent proteinbelastning for hver bane blev bekræftet ved stripning og re-blotting af hver membran ved 4°C mod muse monoklonalt anti-β-actin antistof (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA) ved en fortynding på 1:5000. Analysen blev gentaget 3 gange for at sikre reproducerbarheden af ​​resultaterne. Kvantificering blev udført ved hjælp af ImageJ-software og udtrykt som båndtætheden i forhold til den for β-actin.

Statistisk analyse Dataindtastning og dataanalyse blev udført ved hjælp af SPSS version 19 (Statistisk pakke for samfundsvidenskab). Data blev præsenteret som tal, procent, middelværdi og standardafvigelse for parametriske data. Chi-square test og Fisher exact test blev brugt til at sammenligne kvalitative variabler. Uafhængig t-test blev brugt til at sammenligne kvantitative variable mellem to grupper. Pearson-korrelation blev udført for at måle korrelationen mellem kvantitativ variabel. Medcalc-programmet blev brugt til at beregne sensitivitet, specificitet, positive og negative prædiktive værdier med beregning af AUC (95 % CI). P-værdi blev betragtet som statistisk signifikant, når <0,05.