Survivin és Fibulin-3 jóindulatú és rosszindulatú légúti betegségekben

A vizsgálat felépítése és a résztvevők A jelenlegi prospektív kohorsz-vizsgálatot mindkét nemű, 73, a közelmúltban diagnosztizált jó- és rosszindulatú légúti megbetegedésekkel rendelkező pácienssel végezték, akiket az egyiptomi South Valley Egyetem Qena Egyetemi Kórházainak szív-mellkassebészeti és onkológiai osztályairól vettek fel. A bevont betegeket 4 csoportba soroltuk. Az A csoportba 21 tüdőrákos beteg, a B csoportba 21 különböző jóindulatú tüdőbetegségben szenvedő beteg, a D csoportba 15 rosszindulatú pleurális mesotheliomában (MPM) és az E csoportba 16 különböző jóindulatú pleurális betegségben szenvedő beteg tartozott. Ezen túlmenően 20 életkorban és nemben egyező, nem rokon egészséges alany szolgál kontrollcsoportként (C csoport). Veseelégtelenségben, májelégtelenségben, súlyos kardiopulmonális kompromittációban, koagulopátiában vagy hemodinamikailag instabil betegeket kizárták. A vizsgálatot a South Valley Egyetem Orvostudományi Karának Etikai Bizottsága hagyta jóvá, és a vizsgálatot az Egyiptom Nyilatkozatának megfelelően végezték. Helsinki. Minden érintett alany tájékozott írásbeli hozzájárulását kapott. A tanulmányi idő két év volt, 2017. január 1-től 2019. december 30-ig.

Adatgyűjtés A teljes anamnézis, alapos klinikai vizsgálatot minden bevont betegnél elvégeztük. Ezenkívül radiológiai vizsgálatokat végeztek sima CXR és CT segítségével, valamint rutin laboratóriumi vizsgálatokat (szérum laktát-dehidrogenáz (LDH), összfehérje, albumin, máj- és vesefunkciók, ESR és CBC). Több tüdőbiopsziát vettünk, és szükség esetén kórszövettani vizsgálatra küldtük. Bizonyított pleurális folyadékgyülem esetén toracentézist végeztek. A standard pleurális folyadékanalízis a következőket tartalmazza: pH, a mellhártya/szérum biokémiai vizsgálata (LDH, glükóz, albumin és adenozin-deamináz (ADA), citológiai és mikrobiológiai vizsgálatok (Z-N, L-J kultúra) és differenciális sejtszám) és a Light eredeti kritériumai ( a pleurális folyadék/szérumfehérje aránya >0,5, a pleurális folyadék/szérum LDH aránya >0,6 vagy a pleurális folyadék LDH értéke több mint a normál szérumérték felső határának kétharmada) az exudatív és a transzudatív pleurális effúziók megkülönböztetésére. Határozatlan citológiájú vagy pleurális folyadékanalízissel rendelkező betegeknél torakoszkópot végeztünk, és több pleurális biopsziát vettünk kórszövettani vizsgálat céljából. A rosszindulatú pleurális effúziót akkor diagnosztizálták, ha a pleurális folyadékcitológia vagy a pleurális biopszia pozitív volt a rosszindulatú daganatra.

Az MPM stádiumát van Meerbeeck és munkatársai segítségével, míg a tüdőrákét Lim és munkatársai szerint értékelték.

Vérminták és pleurális folyadékgyülem 5 ml vénás vért vettünk minden érintett alanyból szérumleválasztó gélcsövek segítségével, és hagytuk szobahőmérsékleten 30 percig alvadni, majd 15 percig 1000 g-vel centrifugáltuk. Az elválasztott szérumokat alikvot részekben tároltuk 1 ml-es kriotövek segítségével -80 °C-on a survivin és a fibulin-3 későbbi biokémiai vizsgálataihoz. Ezenkívül a bevont betegek 10 ml pleurális folyadékát 15 percig 1000 g-vel centrifugáltuk, és 1 ml-es kriocsövekkel -80 °C-on alikvot részekben tároltuk a survivin és fibulin-3 expressziós szint későbbi molekuláris vizsgálatához Western blot analízissel.

Az IGF-I és a survivin ELISA-tesztjei A szérum survivin és fibulin-3 mennyiségi meghatározását a Chongqing Biospes Co., Ltd., Kína által szállított, BYE3519, illetve BYEK2017 katalógusszámú, kereskedelemben kapható ELISA vizsgálati kitekkel végeztük. A vizsgálatokat mikrolemez ELISA olvasóval (EMR 500, USA) végeztük a gyártási protokoll szerint.

A survivin és a fibulin-3 expressziós szintjének Western-blot vizsgálata A tüdő- és pleurális biopsziákat jéghideg RIPA lízispufferben (Sigma-Aldrich, Milánó, Olaszország) homogenizáltuk, amely 1% proteázgátló koktélt tartalmazott (Cell Signaling Technology, Inc., MA, USA) Potter-Elvehjem rotor-sztátor homogenizátort (üveg/teflon homogenizátor) használva, teflon mozsártörővel ellátva és -70 °C-on fagyasztva tárolva a szöveti nukleáris survivin és fibulin-3 expressziójának Western-blot technikával történő későbbi értékeléséhez.

Minden megfelelő tüdőben, pleurális szövet homogenizátumban vagy pleurális folyadékgyülemben lévő fehérjéket 95 °C-on 5 percig denaturáltuk 2× Laemmli pufferben, majd 5%-os 2-merkaptoetanolt adtunk hozzá. Az SDS-PAGE elektroforézist úgy értük el, hogy sávonként 50 µg fehérjét töltöttünk 75 V-on rezolváló gélen keresztül (18% survivin és 15% fibulin-3 esetében), majd 125 voltot körülbelül 2 órán keresztül, és T-77 segítségével PVDF membránra vittük át. ECL félszáraz transzfer egység (Amersham BioSciences UK Ltd) 2 órán keresztül. Az immunoblot-vizsgálatot úgy végeztük, hogy a PVDF membránt 0,1% Tween-t és 5% zsírmentes tejet tartalmazó TBS pufferben inkubáltuk egy órán át 4 °C-on, majd egy éjszakán át 4 °C-on nyúl anti-survivin poliklonális antitesttel (Bioss Inc., Massachusetts) (USA) és nyúl anti-fibulin-3 poliklonális antitesttel (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA) 1:1500 hígításban. Miután háromszor mostuk TBST pufferrel, mindegyik membránt 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk lúgos foszfatázzal konjugált kecske anti-egér másodlagos antitesttel (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA) 1:5000 hígításban. . Miután négyszer mostuk TBST-ben, a membránhoz kötött antitestet a kereskedelemben kapható BCIP/NBT szubsztrát detektáló készlettel (Genemed Biotechnologies, Inc., CA, USA) detektáltuk. Az egyes sávok egyenértékű fehérjeterhelését az egyes membránok sztrippelésével és 4 °C-on történő újrablottolásával igazoltuk egér monoklonális anti-β-aktin ellenanyaggal (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA) 1:5000 hígításban. Az analízist háromszor megismételtük az eredmények reprodukálhatóságának biztosítása érdekében. A kvantifikációt ImageJ szoftverrel végeztük, és a β-aktin sűrűségéhez viszonyított sávsűrűségként fejeztük ki.

Statisztikai elemzés Az adatbevitel és az adatelemzés az SPSS 19-es verziójával (Statistical Package for Social Science) történt. Az adatokat számban, százalékban, a parametrikus adatok átlagában és szórásaként adtuk meg. Khi-négyzet tesztet és Fisher egzakt tesztet használtunk a minőségi változók összehasonlítására. Független t-tesztet használtunk a két csoport kvantitatív változóinak összehasonlítására. A mennyiségi változók közötti korreláció mérésére Pearson-korrelációt végeztünk. A Medcalc programot használtuk az érzékenység, a specificitás, a pozitív és negatív prediktív értékek kiszámítására az AUC (95% CI) kiszámításával. A P-értéket akkor tekintettük statisztikailag szignifikánsnak, ha <0,05.