Surwiwina i fibulina-3 w łagodnych i złośliwych chorobach układu oddechowego

Projekt badania i uczestnicy Obecne prospektywne badanie kohortowe przeprowadzono z udziałem 73 pacjentów obojga płci, z niedawno zdiagnozowanymi łagodnymi i złośliwymi chorobami układu oddechowego, rekrutowanych z oddziałów kardiochirurgii i onkologii szpitali uniwersyteckich Qena Uniwersytetu South Valley w Egipcie. Zakwalifikowani pacjenci zostali podzieleni na 4 grupy. Grupa A obejmowała 21 pacjentów z rakiem płuc, grupa B obejmowała 21 pacjentów z różnymi łagodnymi chorobami płuc, grupa D obejmowała 15 pacjentów ze złośliwym międzybłoniakiem opłucnej (MPM), a grupa E obejmowała 16 pacjentów z różnymi łagodnymi chorobami opłucnej. Ponadto 20 niespokrewnionych zdrowych osobników dobranych pod względem wieku i płci służy jako grupa kontrolna (grupa C). Pacjenci z niewydolnością nerek, niewydolnością wątroby, ciężkimi zaburzeniami krążeniowo-oddechowymi, koagulopatią lub niestabilnymi hemodynamicznie zostali wykluczeni. Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Wydziału Lekarskiego South Valley University, Qena, Egipt i zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsinki. Od każdego uwzględnionego podmiotu uzyskano świadomą pisemną zgodę. Badanie trwało dwa lata, od 1 stycznia 2017 do 30 grudnia 2019 roku.

Gromadzenie danych Pełny wywiad, dokładne badania kliniczne przeprowadzono dla każdego pacjenta objętego badaniem. Dodatkowo przeprowadzono ocenę radiologiczną za pomocą zwykłej CXR i CT oraz rutynowe badania laboratoryjne (dehydrogenaza mleczanowa w surowicy (LDH), białko całkowite, albuminy, funkcje wątroby i nerek, OB i CBC). Pobrano wiele biopsji płuc i wysłano je do badania histopatologicznego, gdy było to wskazane. Toracentezę wykonywano w przypadkach z potwierdzonym wysiękiem opłucnowym. Wykonano standardową analizę płynu opłucnowego, w tym: pH, biochemiczne badanie opłucnej/surowicy (LDH, glukoza, albumina i deaminaza adenozynowa (ADA), badanie cytologiczne i mikrobiologiczne (hodowla Z-N, L-J) i różnicowanie liczby komórek) oraz oryginalne kryteria Lighta ( stosunek płynu opłucnowego do białka w surowicy > 0,5, stosunek LDH w opłucnej do surowicy > 0,6 lub LDH w płynie opłucnowym większy niż dwie trzecie górnej granicy normy w surowicy) w celu odróżnienia wysiękowego od przesiękowego wysięku opłucnowego. U pacjentów z niezdecydowaną cytologią lub badaniem płynu opłucnowego wykonywano torakoskopię oraz pobierano liczne biopsje opłucnej do badania histopatologicznego. Złośliwy wysięk w jamie opłucnej rozpoznano, jeśli wyniki cytologii płynu opłucnowego lub biopsji opłucnej były pozytywne w kierunku złośliwości.

Stopień zaawansowania MPM przeprowadzono za pomocą van Meerbeeck i in., podczas gdy stopień zaawansowania raka płuc oceniono według Lim i in.

Próbki krwi i płyn wysiękowy z opłucnej Pobrano pięć ml krwi żylnej od każdego pacjenta objętego badaniem za pomocą żelowych probówek do oddzielania surowicy i pozostawiono do skrzepnięcia w temperaturze pokojowej na 30 minut, a następnie wirowano przez 15 minut przy 1000 g. Oddzielone surowice przechowywano w porcjach przy użyciu 1 ml krioprobówek w temperaturze -80°C do późniejszych testów biochemicznych surwiwiny i fibuliny-3. Dodatkowo, 10 ml płynu opłucnowego od włączonych pacjentów wirowano przez 15 minut przy 1000 g i przechowywano w porcjach przy użyciu 1 ml krioprobówek w temperaturze -80°C do późniejszych testów molekularnych poziomów ekspresji surwiwiny i fibuliny-3 przy użyciu analizy Western blot.

Testy ELISA dla IGF-I i surwiwiny Ilościowe oznaczenia surwiwiny i fibuliny-3 w surowicy przeprowadzono przy użyciu dostępnych w handlu zestawów do testów ELISA dostarczonych przez Chongqing Biospes Co., Ltd, Chiny, o numerach katalogowych odpowiednio BYE3519 i BYEK2017. Testy przeprowadzono przy użyciu czytnika ELISA do mikropłytek (EMR 500, USA), zgodnie z protokołem producenta.

Oceny Western blotting poziomów ekspresji surwiwiny i fibuliny-3 Biopsje płuc i opłucnej homogenizowano w lodowatym buforze do lizy RIPA (Sigma-Aldrich, Mediolan, Włochy), zawierającym 1% koktajl inhibitorów proteazy (Cell Signaling Technology, Inc., MA, USA) przy użyciu homogenizatora rotor-stator Pottera-Elvehjema (homogenizator ze szkła/teflonu), wyposażonego w teflonowy tłuczek i przechowywanego w stanie zamrożonym w temperaturze -70°C do późniejszej oceny ekspresji surwiwiny jądrowej w tkankach i fibuliny-3 techniką Western blotting.

Białka w każdym odpowiednim płucu, homogenaty tkanki opłucnej lub próbkę wysięku opłucnowego denaturowano w temperaturze 95°C przez 5 minut w 2x buforze Laemmli, a następnie dodano 5% 2-merkaptoetanolu. Elektroforezę SDS-PAGE przeprowadzono przez załadowanie 50 µg białka na ścieżkę przy 75 woltach przez żel rozdzielający (18% dla surwiwiny i 15% dla fibuliny-3), a następnie przez 125 woltów przez około 2 godziny i przeniesiono na membranę PVDF przy użyciu T-77 półsuchą jednostkę transferową ECL (Amersham BioSciences UK Ltd) przez 2 godziny. Immunoblotting przeprowadzono przez inkubację błony PVDF w buforze TBS zawierającym 0,1% Tween i 5% odtłuszczonego mleka przez jedną godzinę w 4°C, a następnie inkubację przez noc w 4°C z króliczym przeciwciałem poliklonalnym przeciw surwiwinie (Bioss Inc., Massachusetts , USA) i królicze przeciwciało poliklonalne przeciw fibulinie-3 (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA) w rozcieńczeniu 1:1500. Po trzykrotnym przemyciu buforem TBST, każdą membranę inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z drugorzędowym przeciwciałem kozim anty-mysim skoniugowanym z fosfatazą alkaliczną (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA) w rozcieńczeniu 1: 5000 . Po czterokrotnym przemyciu w TBST, przeciwciało związane z błoną wykrywano za pomocą dostępnego w handlu zestawu do wykrywania substratu BCIP/NBT (Genemed Biotechnologies, Inc., CA, USA). Równoważne obciążenie białkiem dla każdej ścieżki potwierdzono przez odpędzenie i ponowne osuszenie każdej membrany w 4°C wobec mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciw β-aktynie (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA) w rozcieńczeniu 1:5000. Analizę powtórzono 3 razy, aby zapewnić powtarzalność wyników. Ocenę ilościową przeprowadzono przy użyciu oprogramowania ImageJ i wyrażono jako gęstość prążków w stosunku do gęstości β-aktyny.

Analiza statystyczna Wprowadzanie danych i analiza danych zostały wykonane przy użyciu SPSS w wersji 19 (Pakiet Statystyczny dla Nauk Społecznych). Dane przedstawiono w postaci liczbowej, procentowej, średniej i odchylenia standardowego dla danych parametrycznych. Do porównania zmiennych jakościowych zastosowano test chi-kwadrat i dokładny test Fishera. Do porównania zmiennych ilościowych między dwiema grupami zastosowano niezależny test t. Aby zmierzyć korelację między zmienną ilościową, wykonano korelację Pearsona. Program Medcalc został wykorzystany do obliczenia czułości, swoistości, dodatnich i ujemnych wartości predykcyjnych wraz z obliczeniem AUC (95% CI). Wartość P uznano za statystycznie istotną, gdy <0,05.