Survivin og Fibulin-3 ved benigne og ondartede luftveissykdommer

Studiedesign og deltakere Den nåværende prospektive kohortstudien har blitt utført med 73 pasienter av begge kjønn, med nylig diagnostiserte godartede og ondartede luftveissykdommer rekruttert fra kardio-thoraxkirurgiske og onkologiske avdelinger, Qena universitetssykehus, South Valley University, Egypt. De inkluderte pasientene ble kategorisert i 4 grupper. Gruppe A inkluderte 21 pasienter med lungekreft, gruppe B inkluderte 21 pasienter med ulike godartede lungesykdommer, gruppe D inkluderte 15 pasienter med ondartet pleural mesothelioma (MPM) og gruppe E inkluderte 16 pasienter med ulike benigne pleurasykdommer. I tillegg fungerer 20 alders- og kjønnstilpassede urelaterte friske forsøkspersoner som kontrollgruppe (gruppe C). Pasienter med nyresvikt, leversvikt, alvorlig kardiopulmonal kompromittering, koagulopati eller hemodynamisk ustabil ble ekskludert. Studien ble godkjent av den etiske komiteen ved Det medisinske fakultet, South Valley University, Qena, Egypt, og den ble utført i samsvar med erklæringen av Helsinki. Informert skriftlig samtykke er innhentet fra alle inkluderte fag. Studievarigheten var to år fra 1. januar 2017 til 30. desember 2019.

Datainnsamling Full anamnese, grundige kliniske undersøkelser ble tatt for hver inkluderte pasient. I tillegg ble radiologiske vurderinger med vanlig CXR og CT, og rutinemessige laboratorieundersøkelser (serumlaktatdehydrogenase (LDH), totalt protein, albumin, lever- og nyrefunksjoner, ESR og CBC) utført. Flere lungebiopsier ble tatt og sendt til histopatologisk undersøkelse når indisert. Thoracentese ble gjort for tilfeller med påvist pleural effusjon. Standard pleuravæskeanalyse ble gjort inkludert: pH, biokjemisk testing av pleura/serum (LDH, glukose, albumin og adenosindeaminase (ADA), cytologi og mikrobiologisk testing (Z-N, L-J kultur) og differensialcelletall) og Lights opprinnelige kriterier ( forholdet mellom pleuralvæske/serumprotein >0,5, forholdet mellom pleura/serum-LDH >0,6 eller pleuralvæske-LDH mer enn to tredjedeler av øvre grense for normal serumverdi) for å skille ut eksudativ fra transudativ pleuravæske. Thoracoscope ble gjort for pasienter med ubesluttsom cytologi eller pleuralvæskeanalyse, og flere pleurabiopsier ble tatt for histopatologisk undersøkelse. Den ondartede pleurale effusjonen ble diagnostisert hvis pleuralvæskecytologi eller funn av pleuralbiopsi var positive for malignitet.

Stadieinndeling av MPM ble gjort ved å bruke van Meerbeeck et al, mens den for lungekreft ble vurdert i henhold til Lim et al.

Blodprøver og samlinger av pleuraeffusjonsvæske Fem ml venøst ​​blod ble trukket fra hvert inkluderte individ ved å bruke serumseparatorgelrør og fikk koagulere ved romtemperatur i 30 minutter og deretter sentrifugert i 15 minutter ved 1000 g. De separerte sera ble lagret i alikvoter ved bruk av 1 ml kryorør ved -80°C for senere biokjemiske analyser av survivin og fibulin-3. I tillegg ble 10 ml pleuralvæsker fra de inkluderte pasientene sentrifugert i 15 minutter ved 1000g og lagret i alikvoter ved bruk av 1 ml kryorør ved -800C for senere molekylære analyser av survivin- og fibulin-3-ekspresjonsnivåer ved bruk av western blot-analyse.

ELISA-analyser av IGF-I og survivin Kvantitative bestemmelser av serum-survivin og fibulin-3 ble oppnådd ved bruk av kommersielt tilgjengelige ELISA-analysesett levert av Chongqing Biospes Co., Ltd, Kina med henholdsvis katalognummer BYE3519 og BYEK2017. Analysene ble utført ved bruk av mikroplate ELISA-leser (EMR 500, USA), i henhold til produksjonsprotokollen.

Western blotting-vurderinger av ekspresjonsnivåer av survivin og fibulin-3 Lunge- og pleurabiopsier ble homogenisert i iskald RIPA-lysebuffer (Sigma-Aldrich, Milano, Italia), som inneholdt 1 % proteasehemmercocktail (Cell Signaling Technology, Inc., MA, USA) ved bruk av Potter-Elvehjem rotor-stator homogenisator (glass/teflon homogenisator), utstyrt med en teflon støder og lagret frosset ved -70 ° C for påfølgende vurdering av vev kjernefysisk survivin og fibulin-3 uttrykk ved Western blotting teknikk.

Proteiner i hver korresponderende lunge-, pleuravevshomogenat eller pleuraeffusjonsprøve ble denaturert ved 95 °C i 5 minutter i 2 x Laemmli-buffer etterfulgt av tilsetning av 5 % 2-merkaptoetanol. SDS-PAGE-elektroforese ble oppnådd ved å laste 50 µg protein per bane ved 75 volt gjennom resolving gel (18 % for survivin og 15 % for fibulin-3) etterfulgt av 125 volt i løpet av ca. 2 timer og overført til en PVDF-membran ved bruk av T-77 ECL halvtørr overføringsenhet (Amersham BioSciences UK Ltd) i 2 timer. Immunoblotting ble utført ved å inkubere PVDF-membranen i TBS-buffer inneholdende 0,1 % Tween og 5 % fettfri melk i én time ved 4 °C, etterfulgt av inkubasjon over natten ved 4 °C med kanin-anti-survivin polyklonalt antistoff (Bioss Inc., Massachusetts , USA) og kanin anti-fibulin-3 polyklonalt antistoff (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA) i en fortynning på 1:1500. Etter å ha blitt vasket tre ganger med TBST-buffer, ble hver membran inkubert i 1 time ved romtemperatur med et alkalisk fosfatase-konjugert geit-anti-mus sekundært antistoff (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA) i en fortynning på 1:5000 . Etter å ha blitt vasket fire ganger i TBST, ble det membranbundne antistoffet påvist med et kommersielt tilgjengelig BCIP/NBT substratdeteksjonssett (Genemed Biotechnologies, Inc., CA, USA). Ekvivalent proteinbelastning for hver bane ble bekreftet ved stripping og re-blotting av hver membran ved 4°C mot muse monoklonalt anti-β-aktin antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA) ved en fortynning på 1:5000. Analysen ble gjentatt 3 ganger for å sikre reproduserbarheten av resultatene. Kvantifisering ble utført ved bruk av ImageJ-programvare og uttrykt som båndtettheten i forhold til β-aktin.

Statistisk analyse Dataregistrering og dataanalyse ble gjort ved hjelp av SPSS versjon 19 (Statistical Package for Social Science). Data ble presentert som tall, prosent, gjennomsnitt og standardavvik for parametriske data. Chi-kvadrattest og Fisher eksakt test ble brukt for å sammenligne kvalitative variabler. Uavhengig t-test ble brukt for å sammenligne kvantitative variabler mellom to grupper. Pearson-korrelasjon ble gjort for å måle korrelasjonen mellom kvantitativ variabel. Medcalc-programmet ble brukt til å beregne sensitivitet, spesifisitet, positive og negative prediktive verdier med beregning av AUC (95 % KI). P-verdi ble ansett som statistisk signifikant når <0,05.