Survivin ja Fibulin-3 hyvänlaatuisissa ja pahanlaatuisissa hengitystiesairauksissa

Tutkimuksen suunnittelu ja osallistujat Nykyinen prospektiivinen kohorttitutkimus on tehty 73 potilaalla molempia sukupuolia, joilla on äskettäin diagnosoitu hyvänlaatuisia ja pahanlaatuisia hengityselinsairauksia, jotka on värvätty sydän- ja rintakehäkirurgian ja onkologian osastoilta, Qenan yliopistollisista sairaaloista, South Valleyn yliopistosta, Egyptistä. Mukana olleet potilaat luokiteltiin 4 ryhmään. Ryhmässä A oli 21 potilasta, joilla oli keuhkosyöpä, ryhmään B kuului 21 potilasta, joilla oli erilaisia ​​hyvänlaatuisia keuhkosairauksia, ryhmässä D 15 potilasta, joilla oli pahanlaatuinen keuhkopussin mesoteliooma (MPM) ja ryhmässä E 16 potilasta, joilla oli erilaisia ​​hyvänlaatuisia keuhkopussin sairauksia. Lisäksi vertailuryhmänä (ryhmä C) toimii 20 ikä- ja sukupuoliyhteyttä. Potilaat, joilla oli munuaisten vajaatoiminta, maksan vajaatoiminta, vakava kardiopulmonaalinen häiriö, koagulopatia tai hemodynaamisesti epästabiili, suljettiin pois. Tutkimuksen hyväksyi South Valleyn yliopiston lääketieteellisen tiedekunnan eettinen komitea, Qena, Egypti, ja se suoritettiin julistuksen mukaisesti. Helsinki. Tietoinen kirjallinen suostumus on saatu kaikilta mukana olevilta henkilöiltä. Opintojen kesto oli kaksi vuotta 1.1.2017 - 30.12.2019.

Tiedonkeruu Täydellinen historia, perusteelliset kliiniset tutkimukset otettiin jokaisesta mukana olleesta potilaasta. Lisäksi suoritettiin radiologisia arviointeja tavallisella CXR:llä ja CT:llä sekä rutiinilaboratoriotutkimukset (seerumin laktaattidehydrogenaasi (LDH), kokonaisproteiini, albumiini, maksan ja munuaisten toiminta, ESR ja CBC). Otettiin useita keuhkobiopsioita ja lähetettiin histopatologiseen tutkimukseen tarvittaessa. Thoracentesis tehtiin tapauksissa, joissa oli todettu pleuraeffuusio. Standardi keuhkopussin nesteanalyysi tehtiin sisältäen: pH:n, keuhkopussin/seerumin biokemiallisen testauksen (LDH, glukoosi, albumiini ja adenosiinideaminaasi (ADA), sytologiset ja mikrobiologiset testit (Z-N, L-J viljelmä) ja differentiaalisen solumäärän) ja Lightin alkuperäiset kriteerit ( keuhkopussin nesteen ja seerumin proteiinin suhde > 0,5, keuhkopussin ja seerumin LDH:n suhde > 0,6 tai keuhkopussin nesteen LDH yli kaksi kolmasosaa normaalin seerumin arvon ylärajasta) eksudatiivisten ja transudatiivisten keuhkopussin effuusioiden erottamiseksi. Potilaille, joiden sytologia tai keuhkopussin nesteanalyysi oli epäselvä, tehtiin torakoskooppi, ja histopatologista tutkimusta varten otettiin useita keuhkopussin biopsioita. Pahanlaatuinen keuhkopussin effuusio diagnosoitiin, jos keuhkopussin nestesytologia tai keuhkopussin biopsialöydökset olivat positiivisia maligniteetille.

MPM:n vaiheistus tehtiin käyttäen van Meerbeeck et ai., kun taas keuhkosyöpä arvioitiin Limin et al.

Verinäytteet ja keuhkopussin effuusionesteen kokoelmat Viisi ml laskimoverta otettiin jokaiselta koehenkilöltä seerumin erotusgeeliputkia käyttäen ja annettiin hyytyä huoneenlämpötilassa 30 minuuttia ja sitten sentrifugoitiin 15 minuuttia 1000 g:ssä. Erotetut seerumit varastoitiin eriin käyttämällä 1 ml:n kryoputkia -800 °C:ssa myöhempiä surviviini- ja fibuliini-3-biokemiallisia määrityksiä varten. Lisäksi 10 ml keuhkopussin nesteitä mukana olevilta potilailta sentrifugoitiin 15 minuuttia 1 000 g:llä ja varastoitiin eriin käyttäen 1 ml:n kryoputkia -800 °C:ssa myöhempiä surviviini- ja fibuliini-3-ekspressiotasojen molekyylimäärityksiä varten Western blot -analyysiä käyttäen.

IGF-I:n ja surviviinin ELISA-määritykset Seerumin surviviinin ja fibuliini-3:n kvantitatiiviset määritykset suoritettiin käyttämällä kaupallisesti saatavia ELISA-määrityspakkauksia, joita toimittaa Chongqing Biospes Co., Ltd, Kiina, luettelonumeroilla BYE3519 ja BYEK2017. Määritykset suoritettiin käyttämällä mikrolevy-ELISA-lukijaa (EMR 500, USA) valmistusprotokollan mukaisesti.

Surviviinin ja fibuliini-3:n ilmentymistasojen Western blot -arvioinnit Keuhko- ja keuhkopussin biopsiat homogenisoitiin jääkylmässä RIPA-lyysipuskurissa (Sigma-Aldrich, Milano, Italia), joka sisälsi 1 % proteaasi-inhibiittoriseosta (Cell Signaling Technology, Inc., MA, USA) käyttäen Potter-Elvehjem-roottori-staattorihomogenisaattoria (lasi/teflon-homogenisaattori), joka on varustettu teflon-survin ja säilytetty pakastettuna -70 °C:ssa kudostuman surviviini- ja fibuliini-3-ilmentymien myöhempää arviointia varten Western blot -tekniikalla.

Proteiinit kussakin vastaavassa keuhko-, keuhkopussin kudoshomogenaatissa tai pleuraeffuusionäytteessä denaturoitiin 95 °C:ssa 5 minuutin ajan 2 x Laemmli-puskurissa, minkä jälkeen lisättiin 5 % 2-merkaptoetanolia. SDS-PAGE-elektroforeesi saavutettiin lataamalla 50 µg proteiinia kaistaa kohden 75 voltilla erotusgeelin läpi (18 % surviviinille ja 15 % fibuliini-3:lle), mitä seurasi 125 volttia noin 2 tunnin ajan ja siirrettiin PVDF-kalvolle T-77:n avulla. ECL puolikuiva siirtoyksikkö (Amersham BioSciences UK Ltd) 2 tunnin ajan. Immunoblottaus suoritettiin inkuboimalla PVDF-kalvoa TBS-puskurissa, joka sisälsi 0,1 % Tweenia ja 5 % rasvatonta maitoa, yhden tunnin ajan 4 °C:ssa, minkä jälkeen inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa kaniinin anti-surviviini-polyklonaalisella vasta-aineella (Bioss Inc., Massachusetts). , USA) ja kanin anti-fibuliini-3-polyklonaalinen vasta-aine (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA) laimennoksena 1:1500. Kun kalvoa oli pesty kolme kertaa TBST-puskurilla, kutakin kalvoa inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa alkalisella fosfataasilla konjugoidun vuohen anti-hiirivasta-aineen kanssa (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA) laimennuksessa 1:5000. . Sen jälkeen kun kalvoon sitoutunut vasta-aine oli pesty neljä kertaa TBST:ssä, se havaittiin kaupallisesti saatavalla BCIP/NBT-substraattidetektiosarjalla (Genemed Biotechnologies, Inc., CA, USA). Vastaava proteiinikuormitus kullekin kaistalle varmistettiin poistamalla ja blottomalla jokainen kalvo uudelleen 4 °C:ssa hiiren monoklonaalista anti-p-aktiinivasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA) laimennuksella 1:5000. Analyysi toistettiin 3 kertaa tulosten toistettavuuden varmistamiseksi. Kvantitointi suoritettiin käyttämällä ImageJ-ohjelmistoa ja ilmaistiin vyöhyketiheyksinä suhteessa β-aktiinin tiheyteen.

Tilastollinen analyysi Tiedonsyöttö ja data-analyysi suoritettiin käyttämällä SPSS-versiota 19 (Statistic Package for Social Science). Tiedot esitettiin parametristen tietojen lukuina, prosentteina, keskiarvona ja keskihajonnana. Kvalitatiivisten muuttujien vertailussa käytettiin khin neliötestiä ja Fisherin tarkkaa testiä. Riippumatonta t-testiä käytettiin kvantitatiivisten muuttujien vertaamiseen kahden ryhmän välillä. Pearson-korrelaatio tehtiin kvantitatiivisen muuttujan välisen korrelaation mittaamiseksi. Medcalc-ohjelmaa käytettiin herkkyyden, spesifisyyden, positiivisten ja negatiivisten ennustearvojen laskemiseen laskemalla AUC (95 % CI). P-arvoa pidettiin tilastollisesti merkitsevänä, kun <0,05.