Survivina e Fibulina-3 em Doenças Respiratórias Benignas e Malignas

Desenho do estudo e participantes O atual estudo prospectivo de coorte foi realizado com 73 pacientes de ambos os sexos, com doenças respiratórias benignas e malignas recentemente diagnosticadas, recrutados dos Departamentos de Cirurgia Cardiotorácica e Oncologia, Qena University Hospitals, South Valley University, Egito. Os pacientes incluídos foram categorizados em 4 grupos. O grupo A incluiu 21 pacientes com câncer de pulmão, o grupo B incluiu 21 pacientes com várias doenças pulmonares benignas, o grupo D incluiu 15 pacientes com mesotelioma pleural maligno (MPM) e o grupo E incluiu 16 pacientes com várias doenças pleurais benignas. Além disso, 20 indivíduos saudáveis ​​não aparentados pareados por idade e sexo servem como grupo de controle (grupo C). Pacientes com insuficiência renal, insuficiência hepática, comprometimento cardiopulmonar grave, coagulopatia ou hemodinamicamente instáveis ​​foram excluídos O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina, South Valley University, Qena, Egito, e foi conduzido de acordo com a Declaração Helsinque. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os indivíduos incluídos. A duração do estudo foi de dois anos, de 1º de janeiro de 2017 a 30 de dezembro de 2019.

Coleta de dados Histórico completo e exames clínicos completos foram feitos para cada paciente incluído. Além disso, avaliações radiológicas por radiografia simples e tomografia computadorizada e investigações laboratoriais de rotina (lactato desidrogenase sérica (LDH), proteína total, albumina, funções hepática e renal, VHS e hemograma) foram realizadas. Múltiplas biópsias pulmonares foram feitas e enviadas para exame histopatológico quando indicado. A toracocentese foi realizada nos casos com derrame pleural comprovado. A análise padrão do líquido pleural foi feita incluindo: pH, testes bioquímicos de pleura/soro (LDH, glicose, albumina e adenosina desaminase (ADA), citologia e testes microbiológicos (cultura Z-N, L-J) e contagem diferencial de células) e os critérios originais de Light ( proporção de líquido pleural/proteína sérica > 0,5, proporção de LDH pleural/sérico > 0,6 ou LDH de líquido pleural superior a dois terços do limite superior do valor sérico normal) para discriminar derrames pleurais exsudativos de transudativos. O toracoscópio foi feito para pacientes com citologia indecisa ou análise do líquido pleural, e múltiplas biópsias pleurais foram feitas para exame histopatológico. O derrame pleural maligno foi diagnosticado se a citologia do líquido pleural ou os achados da biópsia pleural fossem positivos para malignidade.

O estadiamento do MPM foi feito por van Meerbeeck et al, enquanto o do câncer de pulmão foi avaliado de acordo com Lim et al.

Amostras de sangue e coletas de fluido de efusão pleural Cinco ml de sangue venoso foram retirados de cada indivíduo incluído usando tubos de gel separador de soro e foram deixados coagular em temperatura ambiente por 30 minutos e então centrifugados por 15 minutos a 1000 g. Os soros separados foram armazenados em alíquotas usando criotubos de 1 ml a -800C para posteriores ensaios bioquímicos de survivina e fibulina-3. Além disso, 10 ml de fluidos pleurais dos pacientes incluídos foram centrifugados por 15 minutos a 1000g e armazenados em alíquotas usando criotubos de 1 ml a -800C para posteriores ensaios moleculares dos níveis de expressão de survivina e fibulina-3 usando análise de western blot.

Ensaios ELISA de IGF-I e survivina As determinações quantitativas de survivina e fibulina-3 séricas foram obtidas usando kits de ensaio ELISA disponíveis comercialmente fornecidos por Chongqing Biospes Co., Ltd, China com números de catálogo BYE3519 e BYEK2017, respectivamente. Os ensaios foram realizados usando o leitor de microplacas ELISA (EMR 500, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante.

Avaliações de Western blotting dos níveis de expressão de survivina e fibulina-3 As biópsias pulmonares e pleurais foram homogeneizadas em tampão de lise RIPA gelado (Sigma-Aldrich, Milão, Itália), contendo 1% de coquetel de inibidores de protease (Cell Signaling Technology, Inc., MA, EUA) usando o homogeneizador rotor-estator Potter-Elvehjem (homogeneizador de vidro/teflon), equipado com um pilão de Teflon e armazenado congelado a -70 °C para avaliação subsequente das expressões de survivina nuclear tecidual e fibulina-3 pela técnica de Western blotting.

Proteínas em cada pulmão correspondente, homogenatos de tecido pleural ou amostra de derrame pleural foram desnaturadas a 95 °C por 5 minutos em tampão Laemmli 2 × seguido pela adição de 5% de 2-mercaptoetanol. A eletroforese SDS-PAGE foi obtida carregando 50 µg de proteína por pista a 75 volts através de gel de resolução (18% para survivina e 15% para fibulina-3), seguido de 125 volts durante aproximadamente 2 horas e transferido para uma membrana PVDF usando T-77 Unidade de transferência semi-seca ECL (Amersham BioSciences UK Ltd) por 2 horas. A imunotransferência foi realizada incubando a membrana de PVDF em tampão TBS contendo 0,1% de Tween e 5% de leite desnatado por uma hora a 4°C, seguido de incubação durante a noite a 4°C com anticorpo policlonal anti-survivina de coelho (Bioss Inc., Massachusetts , EUA) e anticorpo policlonal anti-fibulina-3 de coelho (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, EUA) na diluição de 1:1500. Depois de lavadas três vezes com tampão TBST, cada membrana foi incubada por 1 hora em temperatura ambiente com anticorpo secundário de cabra anti-camundongo conjugado com fosfatase alcalina (Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, EUA) na diluição de 1:5.000 . Depois de ser lavado quatro vezes em TBST, o anticorpo ligado à membrana foi detectado com um kit de detecção de substrato BCIP/NBT disponível comercialmente (Genemed Biotechnologies, Inc., CA, EUA). A carga de proteína equivalente para cada pista foi confirmada removendo e manchando cada membrana a 4°C contra anticorpo monoclonal de camundongo anti-β-actina (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, EUA) em uma diluição de 1:5.000. A análise foi repetida 3 vezes para garantir a reprodutibilidade dos resultados. A quantificação foi realizada usando o software ImageJ e expressa como a densidade da banda relativa à da β-actina.

Análise estatística A entrada e análise dos dados foram feitas usando o SPSS versão 19 (Statistical Package for the Social Science). Os dados foram apresentados como número, porcentagem, média e desvio padrão para dados paramétricos. O teste qui-quadrado e o teste exato de Fisher foram usados ​​para comparar variáveis ​​qualitativas. O teste t independente foi usado para comparar variáveis ​​quantitativas entre dois grupos. A correlação de Pearson foi feita para medir a correlação entre as variáveis ​​quantitativas. O programa Medcalc foi usado para calcular a sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivos e negativos com cálculo da AUC (IC 95%). O valor de P foi considerado estatisticamente significativo quando < 0,05.