양성 및 악성 호흡기 질환에서 Survivin 및 Fibulin-3

연구 설계 및 참가자 현재의 전향적 코호트 연구는 이집트 사우스 밸리 대학의 Qena 대학 병원 심장 흉부 외과 및 종양학과에서 모집된 양성 및 악성 호흡기 질환 진단을 받은 남녀 73명의 환자를 대상으로 수행되었습니다. 포함된 환자는 4개의 그룹으로 분류되었다. 그룹 A는 폐암 환자 21명, 그룹 B는 다양한 양성 폐 질환 환자 21명, 그룹 D는 악성 흉막 중피종(MPM) 환자 15명, 그룹 E는 다양한 양성 흉막 질환 환자 16명이었다. 또한 연령과 성별이 일치하는 관련 없는 건강한 피험자 20명이 대조군(그룹 C)으로 사용됩니다. 신부전, 간부전, 중증의 심폐 기능 저하, 응고 장애 또는 혈역학적으로 불안정한 환자는 제외되었습니다. 이 연구는 이집트 Qena의 South Valley University 의학부 윤리위원회의 승인을 받았으며 다음의 선언에 따라 수행되었습니다. 헬싱키. 포함된 모든 피험자로부터 정보에 입각한 서면 동의를 얻었습니다. 연구기간은 2017년 1월 1일부터 2019년 12월 30일까지 2년이었다.

데이터 수집 포함된 모든 환자에 대해 전체 병력, 철저한 임상 검사를 수행했습니다. 또한 일반 CXR 및 CT에 의한 방사선학적 평가와 일상적인 실험실 조사(혈청 젖산 탈수소효소(LDH), 총 단백질, 알부민, 간 및 신장 기능, ESR 및 CBC)가 수행되었습니다. 다수의 폐 생검을 취하여 필요할 때 조직병리학적 검사를 위해 보냈다. 늑막삼출액이 확인된 경우 흉강천자를 시행하였다. pH, 흉막/혈청의 생화학적 검사(LDH, 포도당, 알부민 및 아데노신 데아미나제(ADA), 세포학 및 미생물학적 검사(Z-N, L-J 배양) 및 감별 세포 수) 및 Light의 원래 기준( 흉수/혈청 단백질의 비율 >0.5, 흉막/혈청 LDH의 비율 >0.6 또는 흉수 LDH가 정상 혈청 값의 상한치의 2/3 이상) 삼출성 흉막삼출액과 삼출성 흉수를 구별합니다. 우유부단한 세포검사 또는 흉막액 분석을 보이는 환자에 대해 흉강경을 시행하였고, 조직병리학적 검사를 위해 다수의 흉막 생검을 시행하였다. 흉막액 세포진 검사 또는 흉막 생검 소견에서 악성 종양이 양성이면 악성 흉막삼출액으로 진단하였다.

MPM의 병기는 van Meerbeeck 등을 사용하여 수행한 반면, 폐암은 Lim 등을 사용하여 평가했습니다.

혈액 샘플 및 흉수 수집 혈청 분리기 겔 튜브를 사용하여 포함된 모든 피험자로부터 5ml의 정맥혈을 채취하고 실온에서 30분 동안 응고시킨 다음 1000g에서 15분 동안 원심분리했습니다. 분리된 혈청은 나중에 서바이빈 및 피불린-3의 생화학적 검정을 위해 -800℃에서 1 ml 저온튜브를 사용하여 분취량으로 저장되었다. 또한, 포함된 환자의 흉수 10ml를 1000g에서 15분 동안 원심분리하고 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 서바이빈 및 피불린-3 발현 수준의 이후 분자 분석을 위해 -800C에서 1ml 저온 튜브를 사용하여 분취량으로 저장했습니다.

IGF-I 및 서바이빈의 ELISA 분석 혈청 서바이빈 및 피불린-3의 정량적 측정은 각각 카탈로그 번호 BYE3519 및 BYEK2017로 Chongqing Biospes Co., Ltd, China에서 공급하는 상업적으로 이용 가능한 ELISA 분석 키트를 사용하여 달성되었습니다. 제조 프로토콜에 따라 마이크로플레이트 ELISA 판독기(EMR 500, USA)를 사용하여 검정을 수행하였다.

서바이빈 및 피불린-3 발현 수준의 웨스턴 블롯팅 평가 폐 및 흉막 생검을 1% 프로테아제 억제제 칵테일(Cell Signaling Technology, Inc., MA, 미국) Potter-Elvehjem 회전자-고정자 균질화기(유리/테플론 균질화기)를 사용하여 Teflon 유봉을 장착하고 Western blotting 기술로 조직 핵 서바이빈 및 피불린-3 발현을 평가하기 위해 -70°C에서 냉동 보관했습니다.

각각의 상응하는 폐, 흉막 조직 균질액 또는 흉막 삼출액 샘플의 단백질을 2X Laemmli 완충액에서 5분 동안 95°C에서 변성시킨 후 5% 2-메르캅토에탄올을 첨가했습니다. SDS-PAGE 전기영동은 분해 겔(survivin의 경우 18%, fibulin-3의 경우 15%)을 통해 75볼트에서 레인당 50µg 단백질을 로딩한 다음 약 2시간 동안 125볼트를 로딩하고 T-77을 사용하여 PVDF 멤브레인으로 옮겨 달성했습니다. 2시간 동안 ECL semidry transfer unit(Amersham BioSciences UK Ltd). Immunoblotting은 PVDF 막을 0.1% Tween과 5% 무지방 우유를 포함하는 TBS 완충액에서 1시간 동안 4°C에서 배양한 다음 토끼 항-survivin 다클론 항체(Bioss Inc., Massachusetts)와 함께 4°C에서 밤새 배양하여 수행했습니다. , USA) 및 토끼 항-피불린-3 다클론 항체(Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA)를 1:1500으로 희석하였다. TBST 완충액으로 3회 세척한 후, 각각의 막을 알칼리성 포스파타제 결합 염소 항-마우스 2차 항체(Novus Biologicals, LLC, Littleton, CO, USA)와 1:5000 희석으로 실온에서 1시간 동안 배양하였다. . TBST에서 4회 세척한 후, 막 결합된 항체를 시판되는 BCIP/NBT 기질 검출 키트(Genemed Biotechnologies, Inc., CA, USA)로 검출하였다. 1:5000 희석에서 마우스 단클론 항 β-액틴 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA)에 대해 4°C에서 각 막을 벗겨내고 다시 블롯팅하여 각 레인에 대한 동등한 단백질 로딩을 확인했습니다. 분석은 결과의 재현성을 보장하기 위해 3회 반복되었습니다. 정량화는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수행되었으며 β-액틴에 대한 밴드 밀도로 표현되었습니다.

통계 분석 데이터 입력 및 데이터 분석은 SPSS 버전 19(Statistical Package for Social Science)를 사용하여 수행되었습니다. 데이터는 파라메트릭 데이터에 대한 숫자, 백분율, 평균 및 표준 편차로 표시되었습니다. 카이제곱 검정과 피셔 정확 검정을 이용하여 정성적 변수를 비교하였다. Independent t-test는 두 그룹 간의 정량적 변수를 비교하는 데 사용되었습니다. 양적 변수 간의 상관관계를 측정하기 위해 Pearson 상관관계를 수행하였다. Medcalc 프로그램을 사용하여 AUC(95% CI) 계산과 함께 민감도, 특이도, 양성 및 음성 예측값을 계산했습니다. P-값은 <0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.