Réactivité immunitaire et résultat après chirurgie de la valve aortique (mesure) (Measure)

Conception et méthodes expérimentales :

Paramètre:

Le Barts Heart Center est un centre cardiaque spécialisé de 255 lits où environ 200 procédures primaires de remplacement de valve aortique ouverte isolées sont effectuées chaque année. Il est étroitement associé à la fois géographiquement et académiquement au William Harvey Research Institute (WHRI), qui fait partie de l'Université Queen Mary de Londres (QMUL). Cela permettra l'analyse en laboratoire de tous les échantillons de sang collectés dans les 15 minutes si nécessaire. Le Barts Heart Center est l'une des plus grandes unités cardiaques d'Europe et l'un des principaux objectifs de recherche de QMUL/WHRI est de soutenir la recherche cardiaque.

Prélèvement et stockage des échantillons :

Suite à un consentement éclairé écrit, tous les patients seront évalués en pré-opératoire au moyen de l'ASA, de l'Euroscore 2 et d'une évaluation conventionnelle du risque de développement d'une infection du site opératoire.

Du sang (44 ml au total) sera prélevé sur 150 patients ayant subi un remplacement valvulaire aortique immédiatement avant la chirurgie (T0).

Le sang (7 ml) sera collecté dans un tube PAXgene et stocké à -80° pour une analyse génétique ultérieure. Un échantillon coagulé (7 ml) sera prélevé dans un tube SST standard à bouchon doré, laissé coaguler puis centrifugé pendant 10 minutes à 1000 g, le sérum séparé et stocké à -80 ° pour une analyse ultérieure des niveaux d'anticorps. De plus, 30 ml de sang seront prélevés pour l'étude des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC), prélevées dans des tubes EDTA standard à bouchon violet (anticoagulant). Ceux-ci seront séparés dans les 3 heures suivant la collecte par centrifugation en gradient de densité Ficoll-Paque, au cours de laquelle le sang dilué au PBS est soigneusement superposé sur Ficoll et centrifugé dans une centrifugeuse à 400 g pendant 30 minutes. La couche de PBMC est ensuite extraite et lavée deux fois dans du PBS et stockée dans une solution de congélation à 10% de diméthylsulfoxyde dans de l'azote liquide afin qu'elle puisse être décongelée et analysée par lots à une date ultérieure.

Analyse d'échantillon :

Les PBMC seront comptés à l'aide d'un hémocytomètre, puis cultivés dans du RPMI et 10 % de sérum avec du LPS, de l'α-toxine ou non stimulés pendant 24 heures, après quoi ils seront analysés immédiatement comme détaillé ci-dessous.

• Médiateurs solubles (plasma)

• Stockage : le sang anticoagulé à l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA, BD Biosciences Vacutainer, 9 mL) sera centrifugé (1 200 g, 10 min, 20 °C) et le plasma sera stocké à -80 °C dans les 2 heures suivant le prélèvement.
• Une analyse:

Cytokines : Meso Scale Discovery (MSD) V-PLEX Pro-inflammatoire Panel 1 sera utilisé pour quantifier l'IFN-γ, l'IL-10, l'IL-12p70, l'IL-13, l'IL-1β, l'IL-2, l'IL-4, l'IL-6 , IL-8 et TNF-α. Les plaques seront lues à l'aide d'un imageur MSD QuickPlex SQ 120 (Wiliam Harvey Institute, QMUL).

Anticorps : Ceux-ci seront mesurés au moyen de dosages ELISA contre les antigènes staphylococciques (α-toxine, acide teichoïque) et les fractions centrales de la molécule d'endotoxine (EndoCAb).

• Libération de cytokine stimulée par LPS/α-toxine dans le sang total

  • Technique : Comme décrit précédemment et validé dans notre laboratoire, le sang hépariné sera stimulé pendant 4 heures (37 °C, 250 rpm) avec 1 ng/ml de LPS dans les 2 heures suivant le prélèvement. Après incubation, les échantillons seront centrifugés (1200g, 10mins, 20°C) et le surnageant conservé à -80°C.
  • Quantification des cytokines : conformément aux « médiateurs solubles », le panel 1 pro-inflammatoire MSD V-PLEX sera utilisé pour quantifier le TNF-α (résultat principal en tant que mesure de la compétence immunitaire) et d'autres cytokines. Les cytokines seront exprimées en tant que facteur du nombre de monocytes circulants.

• Immunophénotypage par cytométrie en flux et évaluation fonctionnelle des leucocytes

  • Cytométrie en flux : tous les échantillons seront analysés sur le même appareil (Becton Dickinson (BD) Fortessa, Rayne Building, UCL). La standardisation et la comparaison de la sortie seront réalisées via l'utilisation de tensions constantes et d'une matrice de compensation tout au long de la correspondance quotidienne des valeurs avec un seul lot de billes de configuration et de suivi de cytométrie (CS&T) (BD). La coloration de la surface des cellules leucocytaires sera réalisée à l'aide d'anticorps principalement fournis par BD. La coloration, la saisie et le stockage des données seront effectués conformément à une seule procédure opératoire normalisée pour l'étude. 5 panels (jusqu'à 14 couleurs) et deux tests fonctionnels seront effectués à chaque instant. Les données seront analysées dans FlowJo version 10.5.
  • Coloration des marqueurs de surface :

Panel de quantification et d'étalonnage : CD45, CD56, CD3, CD4, CD8, CD19, CD14, CD16, réalisés dans un tube BD TruCount pour permettre le dénombrement de sous-ensembles de cellules Panels spécifiques aux cellules (incorporant des marqueurs de sous-catégorisation et des marqueurs de compétence immunitaire)

• Monocyte/Myéloïde : CD3, CD19, CD56, CD163, CD16, CD33, CD141, CD206, CD274, CD14, CD1c, CD11c, HLA-DR, CD80, CD123, CD83
• Neutrophiles : CD3, CD19, CD56, HLA-DR, CD64, CD62L, CD11b, CD88, CD66b, CD14, CD11c, CD16, CD184, CD182

• Lymphocyte : CD19, CCR6, CD45RA, CD3, CD4, CD8, CXCR3, CD127, CD62L, CD25, CD56, CD27, CD279 Expression HLA-DR : sera quantifiée sur des monocytes CD14+ à l'aide de billes BD QuantiBrite.

  • Mesures fonctionnelles Phagocytose : La capacité des neutrophiles et des monocytes à phagocyter les bactéries E. coli opsonisées marquées au FITC sera quantifiée via le test PhagoTest (BD) conformément aux instructions du fabricant. le test PhagoBurst (BD) en réponse à E. coli opsonisé non marqué, au phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) et au peptide chimiotactique N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP).

o Les PBMC de l'échantillon préopératoire qui seront stimulés avec du LPS (type et concentration à optimiser via la courbe dose-réponse sur des volontaires sains) et de l'α-toxine subiront une cytométrie en flux pour mesurer l'expression de surface de TLR4 et TLR5, l'expression de surface HLA-DR et quantification de NF-kB à l'aide d'anticorps appropriés validés dans la littérature. À la fin de la stimulation, les cellules seront récoltées et l'ARN extrait pour la (q)PCR quantitative afin d'évaluer l'expression de l'ARNm de l'AID. Bien que les cellules B dans les cultures de PBMC aient été stimulées en présence d'autres types de cellules, principalement des cellules T et des monocytes-macrophages, notre objectif est de mesurer une réponse des cellules B, car l'AID est exclusivement exprimé dans les cellules B.

Suffisamment de sang de volontaires sains est disponible pour que toutes les techniques ci-dessus puissent être pratiquées et optimisées de manière adéquate avant le recrutement des patients.

D'autres points de temps d'échantillonnage seront immédiatement post-op (T1), 24h post-op (T2), sortie (T3) et 4 semaines post-op lors du suivi chirurgical (T4). Le sang prélevé lors du suivi postopératoire de 4 semaines sera testé pour le dosage des anticorps IgG contre EndoCAb, l'α-toxine et l'acide teichoïque. Cela permettra une mesure de recombinaison de commutation de classe. Ce qui sera référencé au degré d'expression de l'ARNm de l'AID.

La population de patients ayant subi un remplacement valvulaire aortique sera suivie pour la mortalité et la morbidité majeure. Ils seront notés selon le C-POMS (score de morbidité postopératoire cardiaque), la durée du séjour à l'UIT et la durée du séjour à l'hôpital. Les patients seront surveillés pour le développement d'une infection du site opératoire (ISO) ou l'acquisition d'une infection nosocomiale postopératoire (HAI). Le suivi post-congé pour l'infection ou la rupture de la plaie se poursuivra pendant 12 mois.

Au moment préopératoire immédiat (T0), parallèlement aux mesures de réponse immunitaire actuellement acceptées, il est prévu d'effectuer un test de réponse immunitaire (LIT) à proximité du patient à l'aide d'un appareil de chimiluminescence portable qui repose sur une explosion oxydative des leucocytes à un stimulus supramaximal (Oxford méditresse). Cela repose sur l'analyse de la réponse dans un échantillon de sang capillaire frais de 10 mcl.

Considérations statistiques :

D'après les données publiées par les centres du monde entier, on sait qu'une proportion de patients développent une infection, soit une infection du site opératoire (ISO), soit une infection nosocomiale (HAI), après une chirurgie de la valve aortique. On sait également que ces patients endurent un séjour plus long à l'hôpital après une intervention chirurgicale.

Les chercheurs ont démontré que parmi ces patients, il existe une variabilité des niveaux d'anticorps contre diverses menaces périopératoires, à savoir l'endotoxine et le staphylocoque.

Les chercheurs ont démontré que chez les patients qui subissent une intervention chirurgicale et qui ont de faibles niveaux d'anticorps circulants contre l'endotoxine et/ou le staphylocoque, il existe une association avec une plus grande probabilité de développer une infection et une durée de séjour postopératoire plus longue. Les enquêteurs estiment que le taux d'infection varie entre 13,5 et 33 %.

Les chercheurs ont précédemment suggéré que l'association entre le niveau d'anticorps et le résultat pourrait être la manifestation d'une capacité altérée sous-jacente chez certains individus à développer une réponse immunitaire normale à ces menaces.

On sait qu'une proportion d'individus ont une réponse immunitaire anormale. Ceci est peut-être le plus évident dans la réponse à la vaccination où des travaux antérieurs ont démontré le manque de réponse immunitaire suite à divers programmes de vaccination et nos propres travaux sur la réponse EndoCAb à la vaccination monovalente contre la typhoïde. Cette non/mauvaise réactivité dans ces études se situe entre 10 et 40 %. Le diagramme illustre la proportion de non-répondeurs (c'est-à-dire une mauvaise réponse immunitaire) s'ils sont également répartis.