Immuunivaste ja tulos aorttaläppäleikkauksen jälkeen (mitta) (Measure)

Kokeellinen suunnittelu ja menetelmät:

Asetus:

Barts Heart Center on 255-paikkainen sydämen erikoiskeskus, jossa suoritetaan noin 200 primaarista eristettyä avoimen aorttaläpän vaihtotoimenpidettä vuodessa. Se liittyy läheisesti sekä maantieteellisesti että akateemisesti William Harveyn tutkimusinstituuttiin (WHRI), joka on osa Lontoon Queen Mary -yliopistoa (QMUL). Tämä mahdollistaa kaikkien kerättyjen verinäytteiden laboratorioanalyysin tarvittaessa 15 minuutin sisällä. Barts Heart Center on yksi suurimmista sydänyksiköistä Euroopassa ja QMUL/WHRI:n keskeinen tutkimustavoite on tukea sydäntutkimusta.

Näytteiden kerääminen ja säilytys:

Kirjallisen tietoisen suostumuksen jälkeen kaikille potilaille tehdään ennen leikkausta riskipisteet ASA:n ja Euroscore 2:n avulla ja tavanomaisesti riskipisteet leikkauskohdan infektion kehittymisen osalta.

Veri (yhteensä 44 ml) otetaan 150 aorttaläpän vaihtopotilaalta välittömästi ennen leikkausta (T0).

Veri (7 ml) kerätään PAXgene-putkeen ja säilytetään -80°:ssa myöhempää geneettistä analyysiä varten. Hyytynyt näyte (7 ml) kerätään tavalliseen kultapäälliseen SST-putkeen, jätetään hyytymään ja sitten sentrifugoidaan 10 minuuttia 1000 g:ssä, seerumi erotetaan ja säilytetään -80°:ssa vasta-ainetasojen myöhempää analyysiä varten. Lisäksi perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC) tutkimista varten otetaan 30 ml verta, joka vedetään tavallisiin purppuranpunaisiin EDTA-putkiin (antikoagulantti). Nämä erotetaan 3 tunnin kuluessa keräämisestä Ficoll-Paque-tiheysgradienttisentrifugoinnilla, jolloin PBS-laimennettu veri kerrostetaan huolellisesti Ficollin päälle ja sentrifugoidaan sentrifugissa 400 g:ssä 30 minuutin ajan. Sitten PBMC-kerros uutetaan ja pestään kahdesti PBS:ssä ja säilytetään 10-prosenttisessa dimetyylisulfoksidin jäädytysliuoksessa nestetypessä, jotta ne voidaan sulattaa, ja erä analysoidaan myöhemmin.

Esimerkkianalyysi:

PBMC:t lasketaan käyttämällä hemosytometriä, sitten viljellään RPMI:ssä ja 10 % seerumissa joko LPS:n, α-toksiinin tai stimuloimattomana 24 tunnin ajan, minkä jälkeen ne analysoidaan välittömästi alla kuvatulla tavalla.

• Liukoiset välittäjät (plasma)

• Säilytys: Etyleenidiamiinitetraetikkahapolla (EDTA, BD Biosciences Vacutainer, 9 ml) antikoaguloitua verta sentrifugoidaan (1200 g, 10 min, 20 °C) ja plasmaa säilytetään -80 °C:ssa 2 tunnin sisällä keräämisestä.
• Analyysi:

Sytokiinit: Meso Scale Discovery (MSD) V-PLEX Proinflammatorista paneelia 1 käytetään kvantifioimaan IFN-y, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6 IL-8 ja TNF-a. Levyt luetaan käyttämällä MSD QuickPlex SQ 120 -kuvalaitetta (Wiliam Harvey Institute, QMUL).

Vasta-aineet: Nämä mitataan ELISA-määrityksillä stafylokokkiantigeenejä (α-toksiini, teikoiinihappo) ja endotoksiinimolekyylin ydinosia (EndoCAb) vastaan.

• Kokoveren LPS/α-toksiinin stimuloitu sytokiinin vapautuminen

  • Tekniikka: Kuten aiemmin on kuvattu ja validoitu laboratoriossamme, heparinisoitua verta stimuloidaan 4 tunnin ajan (37 °C, 250 rpm) 1 ng/ml LPS:llä 2 tunnin sisällä nostamisesta. Inkuboinnin jälkeen näytteet sentrifugoidaan (1200 g, 10 min, 20 °C) ja supernatanttia säilytetään -80 °C:ssa.
  • Sytokiinien kvantifiointi: "Liukoisten välittäjien" mukaisesti MSD V-PLEX Proinflammatorista paneelia 1 käytetään TNF-a:n (ensisijainen tulos immuunikyvyn mittarina) ja muiden sytokiinien kvantifiointiin. Sytokiinit ilmaistaan ​​kiertävien monosyyttien lukumäärän kertoimena.

• Virtaussytometrinen immunofenotyypitys ja leukosyyttien toiminnallinen arviointi

  • Virtaussytometria: Kaikki näytteet analysoidaan samalla koneella (Becton Dickinson (BD) Fortessa, Rayne Building, UCL). Tulosten standardointi ja vertailu saavutetaan käyttämällä vakiojännitteitä ja kompensointimatriisia koko ajan päivittämällä arvojen yhteensovittamisen yhdelle erälle Cytometry Setup and Tracking (CS&T) -helmiä (BD). Leukosyyttisolujen pintavärjäys suoritetaan käyttämällä pääasiassa BD:n toimittamia vasta-aineita. Värjäys, tiedonkeruu ja tallennus suoritetaan yhden tutkimuksen standardin toimintamenettelyn mukaisesti. 5 paneelia (jopa 14 väriä) ja kaksi toiminnallista määritystä suoritetaan kullakin aikapisteellä. Tiedot analysoidaan FlowJo-versiossa 10.5.
  • Pintamerkkivärjäys:

Kvantitointi- ja kalibrointipaneeli: CD45, CD56, CD3, CD4, CD8, CD19, CD14, CD16, suoritettu BD TruCount -putkessa solualaryhmien laskemisen mahdollistamiseksi. Solukohtaiset paneelit (sisältävät alakategorioinnit ja immuunikompetenssin markkereita)

• Monosyytti/myeloidi: CD3, CD19, CD56, CD163, CD16, CD33, CD141, CD206, CD274, CD14, CD1c, CD11c, HLA-DR, CD80, CD123, CD83
• Neutrofiilit: CD3, CD19, CD56, HLA-DR, CD64, CD62L, CD11b, CD88, CD66b, CD14, CD11c, CD16, CD184, CD182

• Lymfosyytit: CD19, CCR6, CD45RA, CD3, CD4, CD8, CXCR3, CD127, CD62L, CD25, CD56, CD27, CD279 HLA-DR:n ilmentyminen: Kvantifioidaan CD14+-monosyyteillä käyttämällä BD QuantiBrite -helmiä.

  • Toiminnalliset toimenpiteet Fagosytoosi: Neutrofiilien ja monosyyttien kyky fagosytoosia opsonoituja FITC-leimattuja E.coli-bakteereja kvantifioidaan PhagoTest-määrityksellä (BD) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Reaktiivinen happipurkaus: Leukosyyttien kvantitatiivinen määritys suoritetaan hapetusti. PhagoBurst-määritys (BD) vasteena leimaamattomalle opsonoidulle E. colille, forboli-12-myristaatti-13-asetaatille (PMA) ja kemotaktiselle peptidille N-formyyli-Met-Leu-Phe (fMLP).

o Leikkausta edeltäville PBMC-näytteille, joita stimuloidaan LPS:llä (tyyppi ja pitoisuus optimoidaan annosvastekäyrällä terveillä vapaaehtoisilla) ja α-toksiinilla, suoritetaan virtaussytometria TLR4- ja TLR5-pinnan ilmentymisen, HLA-DR-pinnan ilmentymisen ja NF-kB:n kvantifiointi käyttämällä sopivia kirjallisuudessa validoituja vasta-aineita. Stimuloinnin lopussa solut kerätään ja RNA uutetaan kvantitatiivista (q)PCR:ää varten AID-mRNA-ilmentymisen arvioimiseksi. Vaikka PBMC-viljelmien B-soluja on stimuloitu muiden solutyyppien, ensisijaisesti T-solujen ja monosyyttien-makrofagien, läsnä ollessa, päätepisteemme on mitata B-soluvaste, koska AID ekspressoituu yksinomaan B-soluissa.

Tervettä vapaaehtoista verta on saatavilla riittävästi, jotta kaikkia yllä olevia tekniikoita voidaan harjoitella ja optimoida riittävästi ennen potilaiden värväämistä.

Muut näytteenottoajat ovat välittömästi leikkauksen jälkeinen (T1), 24 tuntia leikkauksen jälkeen (T2), kotiutus (T3) ja 4 viikkoa leikkauksen jälkeen leikkauksen seurannassa (T4). Neljän viikon leikkauksen jälkeisessä seurannassa kerätystä verestä analysoidaan IgG-vasta-ainemääritys EndoCAb:lle, α-toksiinille ja teikoiinihapolle. Tämä mahdollistaa luokkakytkimen rekombinaation mittaamisen. Mikä viittaa takaisin AID-mRNA:n ilmentymisasteeseen.

Aorttaläpän korvauspotilaiden populaatiota seurataan kuolleisuuden ja vakavan sairastuvuuden suhteen. Ne pisteytetään C-POMS:n (sydämen postoperative morbidity score), ITU-jakson pituuden ja sairaalahoidon pituuden mukaan. Potilaita seurataan leikkauskohdan infektion (SSI) tai post-operatiivisen sairaalainfektion (HAI) kehittymisen varalta. Kotiutuksen jälkeistä haavainfektion tai haavavaurion seurantaa jatketaan 12 kuukautta.

Välittömästi ennen leikkausta aikapisteessä (T0) tällä hetkellä hyväksyttyjen immuunivastemittausten rinnalla on tarkoitus suorittaa lähellä potilasta koskeva immuunivastetesti (LIT) käyttämällä kädessä pidettävää kemiluminesenssilaitetta, joka perustuu leukosyyttien oksidatiiviseen purskeeseen supramaksimaaliseen ärsykkeeseen (Oxford). Medistress). Tämä perustuu vasteen analysointiin 10 ml:n tuoreesta kapillaariverinäytteestä.

Tilastollisia huomioita:

Keskuksista maailmanlaajuisesti julkaistujen tietojen perusteella tiedetään, että osa potilaista saa aorttaläppäleikkauksen jälkeen infektion, joko leikkauspaikan infektion (SSI) tai sairaalainfektion (HAI). Tiedetään myös, että nämä potilaat kestävät pidempään sairaalassa leikkauksen jälkeen.

Tutkijat ovat osoittaneet, että näillä potilailla on vaihtelua eri perioperatiivisten uhkien, nimittäin endotoksiinin ja stafylokokin, vasta-ainetasoissa.

Tutkijat ovat osoittaneet, että potilailla, joille tehdään leikkaus ja joilla on alhainen verenkierrossa oleva endotoksiinin ja/tai stafylokokin vasta-aine, on yhteys suurempaan infektion kehittymisen todennäköisyyteen ja pidempään leikkauksen jälkeiseen oleskeluun. Tutkijat arvioivat, että tartuntaaste vaihtelee 13,5 - 33 prosentin välillä.

Tutkijat ovat aiemmin ehdottaneet, että vasta-ainetason ja lopputuloksen välinen yhteys voi olla osoitus joidenkin yksilöiden taustalla olevasta heikentyneestä kyvystä saada normaali immuunivaste näitä uhkia vastaan.

Tiedetään, että osalla yksilöistä on epänormaali immuunivaste. Tämä näkyy ehkä ilmeisimmin rokotusvasteessa, jossa aikaisempi työ on osoittanut immuunivasteen puutteen eri rokotusohjelmien jälkeen ja omassa työssämme EndoCAb-vasteesta monovalenttiselle lavantautirokotteelle. Tämä ei-huono vaste näissä tutkimuksissa on jossain 10-40%. Kaavio havainnollistaa vastetta jättäneiden (eli huonon immuunivasteen) osuutta, jos he ovat jakautuneet tasaisesti.