Immunantwort und Ergebnis nach Aortenklappenoperation (Messung) (Measure)

Experimentelles Design und Methoden:

Einstellung:

Das Barts Heart Center ist ein spezialisiertes Herzzentrum mit 255 Betten, in dem pro Jahr etwa 200 primär isolierte offene Aortenklappenersatzverfahren durchgeführt werden. Es ist geografisch und akademisch eng mit dem William Harvey Research Institute (WHRI) verbunden, das Teil der Queen Mary University, London (QMUL) ist. Dies ermöglicht bei Bedarf eine Laboranalyse aller gesammelten Blutproben innerhalb von 15 Minuten. Das Barts Heart Center ist eine der größten Herzzentren in Europa und ein wichtiges Forschungsziel von QMUL/WHRI ist die Unterstützung der Herzforschung.

Probenentnahme und -aufbewahrung:

Nach schriftlicher Einverständniserklärung werden alle Patienten präoperativ anhand von ASA, Euroscore 2 und konventionell risikobewertet für die Entwicklung einer Wundinfektion.

Blut (insgesamt 44 ml) wird 150 Patienten mit Aortenklappenersatz unmittelbar vor der Operation (T0) entnommen.

Blut (7 ml) wird in ein PAXgene-Röhrchen gesammelt und für eine spätere genetische Analyse bei -80° gelagert. Eine geronnene Probe (7 ml) wird in einem Standard-Goldverschluss-SST-Röhrchen gesammelt, gerinnen gelassen und dann 10 Minuten lang bei 1000 g zentrifugiert, das Serum abgetrennt und bei -80 °C für eine spätere Analyse der Antikörperspiegel gelagert. Zusätzlich werden 30 ml Blut zur Untersuchung peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMCs) entnommen und in standardmäßige EDTA-Röhrchen mit violettem Verschluss (Antikoagulans) gezogen. Diese werden innerhalb von 3 Stunden nach der Entnahme durch Ficoll-Paque-Dichtegradientenzentrifugation getrennt, wobei PBS-verdünntes Blut sorgfältig über Ficoll geschichtet und in einer Zentrifuge bei 400 g für 30 Minuten abgeschleudert wird. Die PBMC-Schicht wird dann extrahiert und zweimal in PBS gewaschen und in 10%iger Dimethylsulfoxid-Gefrierlösung in flüssigem Stickstoff gelagert, damit sie aufgetaut und zu einem späteren Zeitpunkt chargenweise analysiert werden kann.

Probenanalyse:

PBMCs werden mit einem Hämozytometer gezählt, dann in RPMI und 10 % Serum mit entweder LPS, α-Toxin oder unstimuliert für 24 Stunden kultiviert, wonach sie sofort wie unten beschrieben analysiert werden.

• Lösliche Mediatoren (Plasma)

• Lagerung: Mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, BD Biosciences Vacutainer, 9 ml) antikoaguliertes Blut wird zentrifugiert (1200 g, 10 Minuten, 20 °C) und das Plasma innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme bei -80 °C gelagert
• Analyse:

Zytokine: Meso Scale Discovery (MSD) V-PLEX Proinflammatory Panel 1 wird zur Quantifizierung von IFN-γ, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6 eingesetzt , IL-8 und TNF-α. Die Platten werden unter Verwendung eines MSD QuickPlex SQ 120 Imager (Wiliam Harvey Institute, QMUL) gelesen.

Antikörper: Diese werden mittels ELISA-Assays gegen Staphylokokken-Antigene (α-Toxin, Teichonsäure) und Kerneinheiten des Endotoxinmoleküls (EndoCAb) gemessen.

• Vollblut-LPS/α-Toxin-stimulierte Zytokinfreisetzung

  • Technik: Wie zuvor beschrieben und in unserem Labor validiert, wird heparinisiertes Blut 4 Stunden lang (37 °C, 250 U/min) mit 1 ng/ml LPS innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme stimuliert. Nach der Inkubation werden die Proben zentrifugiert (1200 g, 10 Minuten, 20 °C) und der Überstand bei -80 °C gelagert.
  • Quantifizierung von Zytokinen: Gemäß „löslichen Mediatoren“ wird das MSD V-PLEX Proinflammatory Panel 1 zur Quantifizierung von TNF-α (primäres Ergebnis als Maß für die Immunkompetenz) und anderen Zytokinen eingesetzt. Zytokine werden als Faktor der Anzahl zirkulierender Monozyten ausgedrückt.

• Durchflusszytometrische Immunphänotypisierung und funktionelle Beurteilung von Leukozyten

  • Durchflusszytometrie: Alle Proben werden auf demselben Gerät analysiert (Becton Dickinson (BD) Fortessa, Rayne Building, UCL). Die Standardisierung und der Vergleich der Ausgabe werden durch den Einsatz konstanter Spannungen und einer Kompensationsmatrix durchweg mit täglichem Abgleich der Werte mit einer einzelnen Charge von Cytometry Setup and Tracking (CS&T) Beads (BD) erreicht. Die Oberflächenfärbung von Leukozytenzellen wird unter Verwendung von Antikörpern durchgeführt, die hauptsächlich von BD geliefert werden. Färbung, Datenerfassung und -speicherung werden in Übereinstimmung mit einem Standardverfahren für eine einzelne Studie durchgeführt. Zu jedem Zeitpunkt werden 5 Panels (bis zu 14 Farben) und zwei Funktionsassays durchgeführt. Daten werden in FlowJo Version 10.5 analysiert.
  • Oberflächenmarker-Färbung:

Quantifizierungs- und Kalibrierungspanel: CD45, CD56, CD3, CD4, CD8, CD19, CD14, CD16, durchgeführt in einem BD TruCount-Röhrchen, um die Zählung von Zelluntergruppen zu ermöglichen Zellspezifische Panels (mit Markern der Unterkategorisierung und Markern der Immunkompetenz)

• Monozyten/Myeloid: CD3, CD19, CD56, CD163, CD16, CD33, CD141, CD206, CD274, CD14, CD1c, CD11c, HLA-DR, CD80, CD123, CD83
• Neutrophile: CD3, CD19, CD56, HLA-DR, CD64, CD62L, CD11b, CD88, CD66b, CD14, CD11c, CD16, CD184, CD182

• Lymphozyten: CD19, CCR6, CD45RA, CD3, CD4, CD8, CXCR3, CD127, CD62L, CD25, CD56, CD27, CD279 HLA-DR-Expression: Wird auf CD14+-Monozyten mit BD QuantiBrite-Kügelchen quantifiziert.

  • Funktionelle Maßnahmen Phagozytose: Die Fähigkeit von Neutrophilen und Monozyten, opsonisierte FITC-markierte E.coli-Bakterien zu phagozytieren, wird mit dem PhagoTest-Assay (BD) gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert der PhagoBurst-Assay (BD) als Reaktion auf unmarkierte opsonisierte E. coli, Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) und das chemotaktische Peptid N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP).

o Die PBMCs aus der voroperativen Probe, die mit LPS (Typ und Konzentration sind über die Dosis-Wirkungs-Kurve bei gesunden Freiwilligen zu optimieren) und α-Toxin stimuliert werden, werden einer Durchflusszytometrie unterzogen, um die TLR4- und TLR5-Oberflächenexpression, die HLA-DR-Oberflächenexpression und zu messen Quantifizierung von NF-kB mit geeigneten, in der Literatur validierten Antikörpern. Am Ende der Stimulation werden die Zellen geerntet und die RNA für die quantitative (q)PCR extrahiert, um die AID-mRNA-Expression zu bewerten. Obwohl B-Zellen in den PBMC-Kulturen in Gegenwart anderer Zelltypen, hauptsächlich T-Zellen und Monozyten-Makrophagen, stimuliert wurden, besteht unser Endpunkt darin, eine B-Zell-Antwort zu messen, da AID ausschließlich in B-Zellen exprimiert wird.

Es ist genügend Blut von gesunden Freiwilligen verfügbar, so dass alle oben genannten Techniken vor der Patientenrekrutierung angemessen geübt und optimiert werden können.

Weitere Probenahmezeitpunkte sind unmittelbar nach der Operation (T1), 24 Stunden nach der Operation (T2), Entlassung (T3) und 4 Wochen nach der Operation bei der chirurgischen Nachsorge (T4). Das bei der Nachsorge 4 Wochen nach der Operation entnommene Blut wird auf einen IgG-Antikörpertest gegen EndoCAb, α-Toxin und Teichonsäure untersucht. Dies wird ein Maß für die Rekombination von Klassenschaltern ermöglichen. Dies wird auf den Grad der Expression von AID-mRNA zurückgeführt.

Die Population der Aortenklappenersatzpatienten wird hinsichtlich Mortalität und schwerer Morbidität nachuntersucht. Sie werden nach C-POMS (cardiac post-operative morbidity score), Dauer des ITU-Aufenthalts und Dauer des Krankenhausaufenthalts bewertet. Die Patienten werden auf die Entwicklung einer postoperativen Wundinfektion (SSI) oder den Erwerb einer postoperativen im Krankenhaus erworbenen Infektion (HAI) überwacht. Die Nachsorge nach der Entlassung für Wundinfektionen oder -schäden wird 12 Monate lang fortgesetzt.

Zum unmittelbar präoperativen Zeitpunkt (T0) soll neben derzeit anerkannten Messungen der Immunreaktionsfähigkeit ein patientennaher Test der Immunreaktionsfähigkeit (LIT) unter Verwendung eines tragbaren Chemilumineszenzgeräts durchgeführt werden, das sich auf einen oxidativen Ausbruch von Leukozyten zu einem supramaximalen Stimulus stützt (Oxford Medistress). Dies beruht auf der Analyse der Reaktion in einer frischen Kapillarblutprobe von 10 μl.

Statistische Überlegungen:

Aus veröffentlichten Daten von Zentren weltweit ist bekannt, dass ein Teil der Patienten nach einer Aortenklappenoperation eine Infektion entwickelt, entweder eine postoperative Wundinfektion (SSI) oder eine im Krankenhaus erworbene Infektion (HAI). Es ist auch bekannt, dass diese Patienten nach einer Operation einen längeren Krankenhausaufenthalt ertragen.

Die Forscher haben gezeigt, dass es bei diesen Patienten Unterschiede in den Antikörperspiegeln gegen verschiedene perioperative Bedrohungen gibt, nämlich Endotoxin und Staphylokokken.

Die Forscher haben gezeigt, dass bei Patienten, die sich einer Operation unterziehen und niedrige Konzentrationen zirkulierender Antikörper gegen Endotoxin und/oder Staphylokokken aufweisen, ein Zusammenhang mit einer größeren Wahrscheinlichkeit der Entwicklung einer Infektion und einem längeren postoperativen Aufenthalt besteht. Die Ermittler schätzen, dass die Infektionsrate zwischen 13,5 - 33 % schwankt.

Die Forscher haben zuvor vorgeschlagen, dass der Zusammenhang zwischen Antikörperspiegel und Ergebnis eine Manifestation einer zugrunde liegenden beeinträchtigten Fähigkeit bei einigen Personen sein könnte, eine normale Immunantwort auf diese Bedrohungen aufzubauen.

Es ist bekannt, dass ein Teil der Individuen eine abnorme Immunantwort hat. Dies zeigt sich vielleicht am deutlichsten in der Reaktion auf die Impfung, wo frühere Arbeiten die mangelnde Immunantwort nach verschiedenen Impfprogrammen und unsere eigene Arbeit zur EndoCAb-Reaktion auf die monovalente Typhusimpfung gezeigt haben. Diese nicht/schlechte Reaktionsfähigkeit liegt in diesen Studien zwischen 10 und 40 %. Das Diagramm veranschaulicht den Anteil der Non-Responder (dh schlechte Immunantwort), wenn sie gleichmäßig verteilt sind.