Иммунная реакция и исход после операции на аортальном клапане (измерение) (Measure)

План эксперимента и методы:

Параметр:

Кардиологический центр Бартса — это специализированный кардиологический центр на 255 коек, в котором ежегодно проводится около 200 первичных изолированных операций по замене открытого аортального клапана. Он тесно связан как географически, так и академически с Исследовательским институтом Уильяма Харви (WHRI), который является частью Лондонского университета королевы Марии (QMUL). Это позволит провести лабораторный анализ всех собранных образцов крови в течение 15 минут, если это необходимо. Кардиологический центр Бартса является одним из крупнейших кардиологических отделений в Европе, и ключевой исследовательской целью QMUL/WHRI является поддержка кардиологических исследований.

Сбор и хранение образцов:

После письменного информированного согласия все пациенты будут перед операцией оцениваться по шкале риска с помощью ASA, Euroscore 2 и по обычной шкале риска развития инфекции в области хирургического вмешательства.

Кровь (всего 44 мл) будет взята у 150 пациентов с заменой аортального клапана непосредственно перед операцией (T0).

Кровь (7 мл) будет собрана в пробирку PAXgene и сохранена при температуре -80° для последующего генетического анализа. Свернувшийся образец (7 мл) собирают в стандартную пробирку SST с золотым верхом, оставляют для свертывания, затем центрифугируют в течение 10 минут при 1000g, отделяют сыворотку и хранят при -80° для последующего анализа уровней антител. Кроме того, будет взято 30 мл крови для исследования мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), помещенных в стандартные пробирки с пурпурной крышкой с ЭДТА (антикоагулянт). Они будут разделены в течение 3 часов после сбора с помощью центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Paque, при этом кровь, разбавленная PBS, осторожно наносится на Ficoll и центрифугируется в центрифуге при 400g в течение 30 минут. Затем слой РВМС экстрагируют и дважды промывают в PBS и хранят в 10% растворе для замораживания диметилсульфоксида в жидком азоте, чтобы их можно было разморозить, а позднее провести анализ партии.

Образец анализа:

PBMC будут подсчитывать с помощью гемоцитометра, затем культивировать в RPMI и 10% сыворотке с LPS, α-токсином или нестимулировать в течение 24 часов, после чего они будут немедленно проанализированы, как подробно описано ниже.

• Растворимые медиаторы (плазма)

• Хранение: этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА, BD Biosciences Vacutainer, 9 мл), кровь с антикоагулянтом центрифугируют (1200 г, 10 минут, 20 °C), а плазму хранят при температуре -80 °C в течение 2 часов после сбора.
• Анализ:

Цитокины: Провоспалительная панель V-PLEX 1 исследования мезошкалы (MSD) будет использоваться для количественного определения IFN-γ, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6. , ИЛ-8 и ФНО-α. Планшеты будут считываться с использованием имидж-сканера MSD QuickPlex SQ 120 (Институт Уильяма Харви, QMUL).

Антитела: они будут измерены с помощью анализов ELISA против стафилококковых антигенов (α-токсин, тейхоевая кислота) и ядерных фрагментов молекулы эндотоксина (EndoCAb).

• Высвобождение цитокинов, стимулированное LPS/α-токсином цельной крови

  • Техника: как описано ранее и подтверждено в нашей лаборатории, гепаринизированную кровь стимулируют в течение 4 часов (37°C, 250 об/мин) с помощью 1 нг/мл LPS в течение 2 часов после забора. После инкубации образцы центрифугируют (1200g, 10 минут, 20°C), а супернатант хранят при -80°C.
  • Количественное определение цитокинов: в соответствии с «растворимыми медиаторами» MSD V-PLEX Proвоспалительная панель 1 будет использоваться для количественного определения TNF-α (первичный результат как показатель иммунной компетентности) и других цитокинов. Цитокины будут выражаться как коэффициент количества циркулирующих моноцитов.

• Проточное цитометрическое иммунофенотипирование и функциональная оценка лейкоцитов

  • Проточная цитометрия: все образцы будут анализироваться на одном и том же аппарате (Becton Dickinson (BD) Fortessa, Rayne Building, UCL). Стандартизация и сравнение выходных данных будут достигнуты за счет использования постоянных напряжений и компенсационной матрицы с ежедневным сопоставлением значений с одной партией шариков для настройки и отслеживания цитометрии (CS&T) (BD). Окрашивание поверхности клеток лейкоцитов будет проводиться с использованием антител, в основном поставляемых компанией BD. Окрашивание, сбор и хранение данных будут проводиться в соответствии со стандартной операционной процедурой единого исследования. В каждый момент времени будут выполняться 5 панелей (до 14 цветов) и два функциональных анализа. Данные будут анализироваться в FlowJo версии 10.5.
  • Окрашивание маркером поверхности:

Количественная и калибровочная панель: CD45, CD56, CD3, CD4, CD8, CD19, CD14, CD16, проведенная в пробирке BD TruCount для подсчета подмножеств клеток Панели, специфичные для клеток (включая маркеры субкатегоризации и маркеры иммунной компетентности)

• Моноциты/миелоиды: CD3, CD19, CD56, CD163, CD16, CD33, CD141, CD206, CD274, CD14, CD1c, CD11c, HLA-DR, CD80, CD123, CD83
• Нейтрофилы: CD3, CD19, CD56, HLA-DR, CD64, CD62L, CD11b, CD88, CD66b, CD14, CD11c, CD16, CD184, CD182.

• Лимфоциты: CD19, CCR6, CD45RA, CD3, CD4, CD8, CXCR3, CD127, CD62L, CD25, CD56, CD27, CD279. Экспрессия HLA-DR: будет количественно определена на моноцитах CD14+ с использованием гранул BD QuantiBrite.

  • Функциональные показатели Фагоцитоз: Способность нейтрофилов и моноцитов фагоцитировать опсонизированные FITC-меченые бактерии E.coli будет количественно оцениваться с помощью анализа PhagoTest (BD) в соответствии с инструкциями производителя Активный кислородный «взрыв»: Количественное определение окислительного взрыва лейкоцитов будет проводиться с использованием анализ PhagoBurst (BD) в ответ на немеченые опсонизированные E.coli, форбол-12-миристат-13-ацетат (PMA) и хемотаксический пептид N-формил-Met-Leu-Phe (fMLP).

o Предоперационные образцы PBMC, которые будут стимулированы LPS (тип и концентрация должны быть оптимизированы с помощью кривой доза-ответ на здоровых добровольцах) и α-токсином, будут подвергнуты проточной цитометрии для измерения поверхностной экспрессии TLR4 и TLR5, поверхностной экспрессии HLA-DR и количественная оценка NF-kB с использованием соответствующих антител, подтвержденная в литературе. В конце стимуляции клетки собирают и извлекают РНК для количественной (q) ПЦР для оценки экспрессии мРНК AID. Хотя В-клетки в культурах РВМС стимулировали в присутствии других типов клеток, прежде всего Т-клеток и моноцитов-макрофагов, нашей конечной точкой является измерение ответа В-клеток, поскольку AID экспрессируется исключительно в В-клетках.

Доступно достаточно крови здоровых добровольцев, чтобы все вышеперечисленные методы можно было адекватно практиковать и оптимизировать до набора пациентов.

Дальнейшие временные точки отбора проб будут следующими: сразу после операции (T1), через 24 часа после операции (T2), при выписке (T3) и через 4 недели после операции при хирургическом наблюдении (T4). Кровь, собранная через 4 недели после операции, будет проанализирована на антитела IgG к EndoCAb, α-токсину и тейхоевой кислоте. Это позволит измерить рекомбинацию переключения классов. Что можно отнести к степени экспрессии мРНК AID.

Популяция пациентов с заменой аортального клапана будет отслеживаться на предмет смертности и серьезной заболеваемости. Они будут оцениваться в соответствии с C-POMS (оценка послеоперационной заболеваемости сердца), продолжительностью пребывания в ITU и продолжительностью пребывания в больнице. Пациенты будут находиться под наблюдением на предмет развития инфекции в области хирургического вмешательства (ИОХВ) или приобретения послеоперационной внутрибольничной инфекции (ВБИ). Наблюдение после выписки по поводу раневой инфекции или разрушения будет продолжаться в течение 12 месяцев.

В момент времени непосредственно перед операцией (T0), наряду с принятыми в настоящее время показателями иммунной реактивности, предполагается провести тест иммунологической реактивности (LIT) у пациента с использованием портативного хемилюминесцентного устройства, которое основано на окислительном всплеске лейкоцитов до супрамаксимального стимула (Oxford Медистка). Это основано на анализе ответа в пробе свежей капиллярной крови объемом 10 мкл.

Статистические соображения:

Из опубликованных данных из центров по всему миру известно, что у части пациентов после операции на аортальном клапане развивается инфекция, либо инфекция в области хирургического вмешательства (ИОХВ), либо внутрибольничная инфекция (ВБИ). Также известно, что эти пациенты дольше остаются в стационаре после операции.

Исследователи продемонстрировали, что среди этих пациентов наблюдается вариабельность уровней антител к различным периоперационным угрозам, а именно к эндотоксину и стафилококку.

Исследователи продемонстрировали, что у оперируемых пациентов с низким уровнем циркулирующих антител к эндотоксину и/или стафилококку существует ассоциация с большей вероятностью развития инфекции и более длительным послеоперационным периодом. По оценкам исследователей, уровень заражения колеблется от 13,5 до 33%.

Исследователи ранее предполагали, что связь между уровнем антител и исходом может быть проявлением основной нарушенной способности у некоторых людей формировать нормальный иммунный ответ на эти угрозы.

Известно, что часть людей имеют аномальный иммунный ответ. Это, пожалуй, наиболее очевидно проявляется в ответе на вакцинацию, где предыдущая работа продемонстрировала отсутствие иммунного ответа после различных программ вакцинации, и наша собственная работа по ответу EndoCAb на моновалентную вакцинацию против брюшного тифа. Эта не-/плохая отзывчивость в этих исследованиях находится где-то между 10 и 40%. На диаграмме показана доля не ответивших (т.е. с плохой иммунной реакцией), если они распределены поровну.