Respuesta inmunitaria y resultado después de la cirugía de válvula aórtica (medida) (Measure)

Diseño experimental y métodos:

Entorno:

Barts Heart Center es un centro cardíaco especializado con 255 camas donde se realizan aproximadamente 200 procedimientos primarios aislados de reemplazo de válvula aórtica abierta por año. Está estrechamente asociado tanto geográfica como académicamente con el Instituto de Investigación William Harvey (WHRI), que forma parte de la Universidad Queen Mary de Londres (QMUL). Esto permitirá el análisis de laboratorio de todas las muestras de sangre recolectadas dentro de los 15 minutos si es necesario. Barts Heart Center es una de las unidades cardíacas más grandes de Europa y un objetivo de investigación clave de QMUL/WHRI es apoyar la investigación cardíaca.

Recolección y almacenamiento de muestras:

Tras el consentimiento informado por escrito, a todos los pacientes se les evaluará el riesgo preoperatorio mediante ASA, Euroscore 2 y el riesgo convencional para el desarrollo de infección del sitio quirúrgico.

Se extraerá sangre (44 ml en total) de 150 pacientes con reemplazo de válvula aórtica inmediatamente antes de la cirugía (T0).

La sangre (7 ml) se recogerá en un tubo PAXgene y se almacenará a -80° para su posterior análisis genético. Se recogerá una muestra coagulada (7 ml) en un tubo estándar de SST con tapa dorada, se dejará coagular y luego se centrifugará durante 10 minutos a 1000 g, el suero se separará y se almacenará a -80° para un análisis posterior de los niveles de anticuerpos. Además, se tomarán 30 ml de sangre para el estudio de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), extraídas en tubos estándar con tapa morada EDTA (anticoagulante). Estos se separarán dentro de las 3 horas posteriores a la recolección mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-Paque, por lo que la sangre diluida con PBS se coloca cuidadosamente sobre Ficoll y se centrifuga en una centrífuga a 400 g durante 30 minutos. A continuación, la capa de PBMC se extrae y se lava dos veces en PBS y se almacena en una solución de congelación de sulfóxido de dimetilo al 10 % en nitrógeno líquido para que pueda descongelarse y analizarse por lotes en una fecha posterior.

Análisis de muestra:

Las PBMC se contarán con un hemocitómetro, luego se cultivarán en RPMI y suero al 10 % con LPS, toxina α o sin estimular durante 24 horas, después de lo cual se analizarán inmediatamente como se detalla a continuación.

• Mediadores Solubles (Plasma)

• Almacenamiento: La sangre anticoagulada con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, BD Biosciences Vacutainer, 9 ml) se centrifugará (1200 g, 10 minutos, 20 °C) y el plasma se almacenará a -80 °C dentro de las 2 horas posteriores a la recolección.
• Análisis:

Citoquinas: Meso Scale Discovery (MSD) V-PLEX Proinflamatorio Panel 1 se empleará para cuantificar IFN-γ, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6 , IL-8 y TNF-α. Las placas se leerán utilizando un generador de imágenes MSD QuickPlex SQ 120 (Wiliam Harvey Institute, QMUL).

Anticuerpos: Se medirán mediante ensayos ELISA frente a antígenos estafilocócicos (α-toxina, ácido teicoico) y fracciones centrales de la molécula de endotoxina (EndoCAb).

• Liberación de citoquinas estimulada por LPS/α-toxina en sangre entera

  • Técnica: Como se describió anteriormente y validó en nuestro laboratorio, la sangre heparinizada se estimulará durante 4 horas (37 °C, 250 rpm) con 1 ng/ml de LPS dentro de las 2 horas posteriores a la extracción. Después de la incubación, las muestras se centrifugarán (1200 g, 10 minutos, 20 °C) y el sobrenadante se almacenará a -80 °C.
  • Cuantificación de citocinas: según los 'mediadores solubles', se empleará el panel proinflamatorio 1 de MSD V-PLEX para cuantificar el TNF-α (resultado principal como medida de competencia inmunitaria) y otras citocinas. Las citocinas se expresarán como un factor del número de monocitos circulantes.

• Inmunofenotipificación por citometría de flujo y evaluación funcional de leucocitos

  • Citometría de flujo: todas las muestras se analizarán en la misma máquina (Becton Dickinson (BD) Fortessa, Rayne Building, UCL). La estandarización y la comparación de la salida se lograrán mediante el empleo de voltajes constantes y una matriz de compensación en todo momento con la coincidencia diaria de valores con un solo lote de microesferas (BD) de configuración y seguimiento de citometría (CS&T). La tinción de la superficie de las células leucocitarias se realizará utilizando anticuerpos suministrados principalmente por BD. La tinción, la captura y el almacenamiento de datos se realizarán de acuerdo con un procedimiento operativo estándar de estudio único. Se realizarán 5 paneles (hasta 14 colores) y dos ensayos funcionales en cada punto de tiempo. Los datos se analizarán en FlowJo versión 10.5.
  • Tinción de marcador de superficie:

Panel de cuantificación y calibración: CD45, CD56, CD3, CD4, CD8, CD19, CD14, CD16, realizado en un tubo BD TruCount para permitir la enumeración de subconjuntos de células Paneles específicos de células (que incorporan marcadores de subcategorización y marcadores de inmunocompetencia)

• Monocitos/mieloide: CD3, CD19, CD56, CD163, CD16, CD33, CD141, CD206, CD274, CD14, CD1c, CD11c, HLA-DR, CD80, CD123, CD83
• Neutrófilos: CD3, CD19, CD56, HLA-DR, CD64, CD62L, CD11b, CD88, CD66b, CD14, CD11c, CD16, CD184, CD182

• Linfocitos: CD19, CCR6, CD45RA, CD3, CD4, CD8, CXCR3, CD127, CD62L, CD25, CD56, CD27, CD279 Expresión de HLA-DR: se cuantificará en monocitos CD14+ utilizando perlas BD QuantiBrite.

  • Medidas funcionales Fagocitosis: la capacidad de los neutrófilos y los monocitos para fagocitar bacterias E.coli marcadas con FITC opsonizadas se cuantificará a través del ensayo PhagoTest (BD) según las instrucciones del fabricante "explosión" de oxígeno reactivo: la determinación cuantitativa de la explosión oxidativa de los leucocitos se llevará a cabo utilizando el ensayo PhagoBurst (BD) en respuesta a E. coli opsonizada no marcada, 13-acetato de forbol 12-miristato (PMA) y el péptido quimiotáctico N-formil-Met-Leu-Phe (fMLP).

o Las PBMC de la muestra previa a la cirugía que se estimularán con LPS (el tipo y la concentración se optimizarán a través de la curva de respuesta a la dosis en voluntarios sanos) y la toxina α se someterán a citometría de flujo para medir la expresión superficial de TLR4 y TLR5, la expresión superficial de HLA-DR y cuantificación de NF-kB usando anticuerpos apropiados validados en la literatura. Al final de la estimulación, se recolectarán las células y se extraerá el ARN para (q)PCR cuantitativa para evaluar la expresión del ARNm de AID. Aunque las células B en los cultivos de PBMC se han estimulado en presencia de otros tipos de células, principalmente células T y monocitos-macrófagos, nuestro criterio de valoración es medir una respuesta de células B, ya que la AID se expresa exclusivamente en células B.

Hay suficiente sangre de voluntarios sanos disponible para que todas las técnicas anteriores puedan practicarse y optimizarse adecuadamente antes del reclutamiento de pacientes.

Otros puntos temporales de muestreo serán inmediatamente después de la operación (T1), 24 horas después de la operación (T2), alta (T3) y 4 semanas después de la operación en el seguimiento quirúrgico (T4). La sangre recolectada en el seguimiento de 4 semanas después de la cirugía se analizará para el ensayo de anticuerpos IgG contra EndoCAb, toxina α y ácido teicoico. Esto permitirá una medida de recombinación de cambio de clase. Lo cual será remitible al grado de expresión del ARNm de AID.

La población de pacientes con reemplazo de válvula aórtica será objeto de un seguimiento de la mortalidad y la morbilidad mayor. Se calificarán según C-POMS (puntuación de morbilidad postoperatoria cardíaca), duración de la estancia en la UTI y duración de la estancia hospitalaria. Los pacientes serán monitoreados para detectar el desarrollo de infección en el sitio quirúrgico (SSI) o la adquisición de infección postoperatoria adquirida en el hospital (HAI). El seguimiento posterior al alta por infección o ruptura de la herida continuará durante 12 meses.

En el punto de tiempo inmediatamente preoperatorio (T0), junto con las medidas actualmente aceptadas de respuesta inmunológica, se pretende realizar una prueba de respuesta inmunológica (LIT) cerca del paciente utilizando un dispositivo de quimioluminiscencia portátil que se basa en el estallido oxidativo de leucocitos a un estímulo supramáximo (Oxford Medistress). Esto se basa en el análisis de la respuesta en una muestra de sangre capilar fresca de 10 mcl.

Consideraciones estadísticas:

A partir de los datos publicados de centros de todo el mundo, se sabe que una proporción de pacientes desarrollan una infección, ya sea infección del sitio quirúrgico (SSI) o infección adquirida en el hospital (HAI), después de la cirugía de la válvula aórtica. También se sabe que estos pacientes soportan una estancia más prolongada en el hospital después de la cirugía.

Los investigadores han demostrado que entre estos pacientes existe una variabilidad en los niveles de anticuerpos frente a diversas amenazas perioperatorias, a saber, endotoxinas y estafilococos.

Los investigadores han demostrado que en los pacientes que se someten a cirugía y tienen niveles bajos de anticuerpos circulantes contra endotoxinas y/o estafilococos existe una asociación con una mayor probabilidad de desarrollar una infección y una estancia postoperatoria más prolongada. Los investigadores estiman que la tasa de infección varía entre el 13,5 y el 33 %.

Los investigadores sugirieron previamente que la asociación entre el nivel de anticuerpos y el resultado puede ser una manifestación de una capacidad disminuida subyacente en algunos individuos para generar una respuesta inmunitaria normal a estas amenazas.

Se sabe que una proporción de individuos tienen una respuesta inmune anormal. Esto quizás se vea de manera más obvia en la respuesta a la vacunación, donde el trabajo anterior ha demostrado la falta de respuesta inmune después de varios programas de vacunación y nuestro propio trabajo sobre la respuesta de EndoCAb a la vacunación contra la fiebre tifoidea monovalente. Esta capacidad de respuesta nula/pobre en estos estudios se sitúa entre el 10 y el 40 %. El diagrama ilustra la proporción de personas que no responden (es decir, poca capacidad de respuesta inmunitaria) si están distribuidas por igual.