Immunválasz és eredmény aortabillentyű műtét után (mérés) (Measure)

Kísérleti tervezés és módszerek:

Beállítás:

A Barts Heart Center egy 255 ágyas kardiológiai szakközpont, ahol évente körülbelül 200 elsődleges izolált nyitott aortabillentyű pótlási eljárást végeznek. Mind földrajzilag, mind akadémiailag szorosan kapcsolódik a William Harvey Kutatóintézethez (WHRI), amely a londoni Queen Mary University (QMUL) részét képezi. Ez szükség esetén lehetővé teszi az összes begyűjtött vérminta laboratóriumi elemzését 15 percen belül. A Barts Heart Center az egyik legnagyobb kardiológiai egység Európában, és a QMUL/WHRI kulcsfontosságú kutatási célja a szívkutatás támogatása.

Mintagyűjtés és tárolás:

A tájékoztatáson alapuló írásos beleegyezést követően minden betegnél a műtét előtti kockázatpontozást ASA, Euroscore 2 segítségével, és hagyományosan kockázatpontozást végeznek a műtéti hely fertőzésének kialakulására vonatkozóan.

Közvetlenül a műtét előtt (T0) 150 aortabillentyű-cserebetegtől vesznek vért (összesen 44 ml).

A vért (7 ml) egy PAXgene csőbe gyűjtik, és -80°-on tárolják későbbi genetikai elemzés céljából. Az alvadt mintát (7 ml) egy standard arany felső SST csőbe gyűjtjük, hagyjuk alvadni, majd 10 percig centrifugáljuk 1000 g-vel, a szérumot elválasztjuk és -80 °C-on tároljuk az antitestszintek későbbi elemzéséhez. Ezenkívül 30 ml vért vesznek a perifériás vér mononukleáris sejtjeinek (PBMC-k) tanulmányozására, amelyet standard lila felső EDTA-csövekbe vesznek (antikoaguláns). Ezeket a begyűjtést követő 3 órán belül elválasztják Ficoll-Paque sűrűséggradiens centrifugálással, amelynek során a PBS-sel hígított vért óvatosan Ficollra rétegezik, és centrifugában 400 g-vel 30 percig centrifugálják. A PBMC-réteget ezután extraháljuk és kétszer mossuk PBS-ben, majd 10%-os dimetil-szulfoxid fagyasztóoldatban, folyékony nitrogénben tároljuk, hogy felolvaszthassák, és egy későbbi időpontban a tételeket elemezni lehessen.

Mintaelemzés:

A PBMC-ket hemocitométer segítségével megszámoljuk, majd RPMI-ben és 10% szérumban tenyésztjük LPS-sel, α-toxinnal vagy stimulálatlanul 24 órán keresztül, majd az alábbiakban részletezett módon azonnal elemzik őket.

• Oldható közvetítők (plazma)

• Tárolás: Az etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA, BD Biosciences Vacutainer, 9 ml) véralvadásgátló vért centrifugálják (1200 g, 10 perc, 20 °C), és a plazmát -80 °C-on tárolják a begyűjtést követő 2 órán belül.
• Elemzés:

Citokinek: Meso Scale Discovery (MSD) V-PLEX Proinflammatorikus Panel 1-t használunk az IFN-y, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6 mennyiségi meghatározására IL-8 és TNF-a. A lemezek leolvasása MSD QuickPlex SQ 120 képalkotó segítségével történik (Wiliam Harvey Institute, QMUL).

Antitestek: Ezeket ELISA-vizsgálatokkal mérik a staphylococcus antigének (α-toxin, teichoinsav) és az endotoxin molekula (EndoCAb) magrészei ellen.

• Teljes vér LPS/α-toxin stimulált citokin felszabadulás

  • Technika: Amint azt korábban leírtuk és laboratóriumunkban validáltuk, a heparinizált vért 4 órán keresztül (37 °C, 250 fordulat/perc) 1 ng/ml LPS-sel stimuláljuk a levételt követő 2 órán belül. Inkubálás után a mintákat centrifugáljuk (1200 g, 10 perc, 20 °C), és a felülúszót -80 °C-on tároljuk.
  • Citokinek mennyiségi meghatározása: Az „oldható mediátorok” szerint az MSD V-PLEX Proinflammatorikus 1. panelt használják a TNF-α (elsődleges eredmény, mint az immunkompetencia mérőszáma) és más citokinek mennyiségi meghatározására. A citokineket a keringő monociták számának tényezőjeként fejezzük ki.

• A leukociták áramlási citometriás immunfenotipizálása és funkcionális értékelése

  • Áramlási citometria: Az összes mintát ugyanazon a gépen (Becton Dickinson (BD) Fortessa, Rayne Building, UCL) elemzik. A szabványosítást és a kimenet összehasonlítását állandó feszültségek és kompenzációs mátrix alkalmazásával érik el, az értékek napi illesztésével egyetlen köteg Citometry Setup and Tracking (CS&T) gyöngyhöz (BD). A leukocita sejtfelszín festését elsősorban a BD által szállított antitestek felhasználásával végezzük. A festést, az adatrögzítést és a tárolást egyetlen vizsgálati szabvány működési eljárásának megfelelően végzik. Minden időpontban 5 panel (legfeljebb 14 színű) és két funkcionális assay kerül végrehajtásra. Az adatok elemzése a FlowJo 10.5-ös verziójában történik.
  • Felületi marker festés:

Számszerűsítő és kalibráló panel: CD45, CD56, CD3, CD4, CD8, CD19, CD14, CD16, BD TruCount csőben végezve, lehetővé téve a sejtalkészletek számbavételét.

• Monocita/mieloid: CD3, CD19, CD56, CD163, CD16, CD33, CD141, CD206, CD274, CD14, CD1c, CD11c, HLA-DR, CD80, CD123, CD83
• Neutrophil: CD3, CD19, CD56, HLA-DR, CD64, CD62L, CD11b, CD88, CD66b, CD14, CD11c, CD16, CD184, CD182

• Limfocita: CD19, CCR6, CD45RA, CD3, CD4, CD8, CXCR3, CD127, CD62L, CD25, CD56, CD27, CD279 HLA-DR expresszió: CD14+ monocitákon BD QuantiBrite gyöngyök segítségével határozzuk meg.

  • Funkcionális intézkedések Fagocitózis: A neutrofilek és monociták azon képességét, hogy fagocitózzák az opszonizált FITC-jelölt E.coli baktériumokat, a PhagoTest teszttel (BD) a gyártó utasításai szerint számszerűsítik. a PhagoBurst assay (BD) válaszul a jelöletlen opszonizált E. colira, a forbol-12-mirisztát-13-acetátra (PMA) és az N-formil-Met-Leu-Phe (fMLP) kemotaktikus peptidre.

o A műtét előtti minta PBMC-ket, amelyeket LPS-sel (egészséges önkénteseken a dózis-válasz görbével optimalizálunk) és α-toxinnal stimulálunk, áramlási citometriás vizsgálatnak vetjük alá a TLR4 és TLR5 felszíni expresszió, HLA-DR felszíni expresszió és az NF-kB mennyiségi meghatározása a szakirodalomban validált megfelelő antitestek felhasználásával. A stimuláció végén a sejteket összegyűjtik, és RNS-t extrahálnak kvantitatív (q)PCR-hez, hogy kiértékeljék az AID mRNS expresszióját. Bár a PBMC tenyészetekben a B-sejteket más sejttípusok, elsősorban T-sejtek és monociták-makrofágok jelenlétében is stimulálták, végpontunk a B-sejtes válasz mérése, mivel az AID kizárólag B-sejtekben expresszálódik.

Elegendő egészséges önkéntes vér áll rendelkezésre ahhoz, hogy az összes fenti technikát megfelelően be lehessen gyakorolni és optimalizálni lehessen a betegek toborzása előtt.

A további mintavételi időpontok közvetlenül a műtét után (T1), a műtét utáni 24 órával (T2), az elbocsátás (T3) és a műtét utáni 4 héttel a műtét utáni időpontban (T4) lesznek. A 4 hetes műtét utáni utánkövetés során gyűjtött vért megvizsgálják az EndoCAb, az α-toxin és a teichoinsav elleni IgG antitestek meghatározására. Ez lehetővé teszi az osztályváltó rekombináció mértékét. Ami visszavezethető az AID mRNS expressziójának mértékére.

Az aortabillentyű cserén átesett betegek populációját nyomon követik a mortalitás és a súlyos morbiditás tekintetében. Pontozásuk a C-POMS (kardiális posztoperatív morbiditási pontszám), az ITU-ban töltött idő és a kórházi tartózkodás időtartama szerint történik. A betegeket ellenőrizni fogják a műtéti hely fertőzésének (SSI) vagy a műtét utáni kórházban szerzett fertőzés (HAI) megszerzésének szempontjából. Az elbocsátás utáni sebfertőzés vagy sérülés miatti nyomon követés 12 hónapig folytatódik.

A közvetlenül a műtét előtti időpontban (T0) az immunválasz jelenleg elfogadott mérései mellett a tervek szerint a pácienshez közeli immunválasztesztet (LIT) kell elvégezni egy kézi kemilumineszcens eszközzel, amely a leukocita oxidatív robbanásán alapul egy szupramaximális ingerhez (Oxford). Medistress). Ez egy 10 ml-es friss kapilláris vérmintában kapott válasz elemzésén alapul.

Statisztikai megfontolások:

A központok világszerte közzétett adataiból ismert, hogy a betegek egy része aortabillentyű műtétet követően fertőzést, akár műtéti hely fertőzést (SSI) vagy kórházban szerzett fertőzést (HAI) fejleszt ki. Az is ismert, hogy ezek a betegek hosszabb ideig tartó kórházi tartózkodást viselnek a műtét után.

A kutatók kimutatták, hogy ezeknél a betegeknél a különböző perioperatív fenyegetésekkel, nevezetesen az endotoxinnal és a staphylococcusszal szembeni antitestek szintje változó.

A kutatók kimutatták, hogy a műtéten átesett betegeknél, akiknél alacsony a keringő endotoxin és/vagy staphylococcus elleni antitest szintje, összefüggés van a fertőzés kialakulásának nagyobb valószínűségével és a hosszabb posztoperatív tartózkodással. A kutatók becslése szerint a fertőzések aránya 13,5 és 33% között változik.

A kutatók korábban azt sugallták, hogy az antitestszint és a kimenetel közötti összefüggés bizonyos személyek azon képességének megnyilvánulása lehet, hogy normális immunválaszt alakítanak ki ezekkel a fenyegetésekkel szemben.

Ismeretes, hogy az egyének egy részének immunválasza rendellenes. Ez talán a legnyilvánvalóbban az oltásra adott válaszban mutatkozik meg, ahol a korábbi munkák kimutatták az immunválasz hiányát a különböző oltási programokat követően, valamint a monovalens tífusz elleni oltásra adott EndoCAb-reakcióval kapcsolatos munkánkat. Ez a nem/rossz válaszkészség ezekben a vizsgálatokban valahol 10 és 40% között mozog. A diagram szemlélteti a nem reagálók (azaz gyenge immunválasz) arányát, ha egyenlően oszlanak meg.