Odpowiedź immunologiczna i wynik po operacji zastawki aortalnej (miara) (Measure)

Projekt eksperymentu i metody:

Ustawienie:

Barts Heart Center to specjalistyczny ośrodek kardiologiczny z 255 łóżkami, w którym rocznie wykonuje się około 200 pierwotnych izolowanych zabiegów wymiany otwartej zastawki aortalnej. Jest ściśle powiązany zarówno geograficznie, jak i akademicko z William Harvey Research Institute (WHRI), który stanowi część Queen Mary University w Londynie (QMUL). Pozwoli to w razie potrzeby na analizę laboratoryjną wszystkich pobranych próbek krwi w ciągu 15 minut. Barts Heart Center jest jedną z największych jednostek kardiologicznych w Europie, a kluczowym celem badawczym QMUL/WHRI jest wspieranie badań kardiologicznych.

Pobieranie i przechowywanie próbek:

Po wyrażeniu pisemnej świadomej zgody wszyscy pacjenci zostaną poddani przedoperacyjnej ocenie ryzyka za pomocą ASA, Euroscore 2 oraz konwencjonalnej ocenie ryzyka rozwoju zakażenia miejsca operowanego.

Krew (łącznie 44 ml) zostanie pobrana od 150 pacjentów po wymianie zastawki aortalnej bezpośrednio przed operacją (T0).

Krew (7 ml) zostanie pobrana do probówki PAXgene i przechowywana w temperaturze -80° do późniejszej analizy genetycznej. Skrzepnięta próbka (7 ml) zostanie zebrana do standardowej probówki SST ze złotym wieczkiem, pozostawiona do skrzepnięcia, a następnie odwirowana przez 10 minut przy 1000 g, oddzielona surowica i przechowywana w temperaturze -80° do późniejszej analizy poziomów przeciwciał. Ponadto zostanie pobrane 30 ml krwi do badania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), pobranej do standardowych probówek z fioletowym wieczkiem EDTA (antykoagulant). Zostaną one rozdzielone w ciągu 3 godzin od pobrania przez wirowanie w gradiencie gęstości Ficoll-Paque, podczas którego krew rozcieńczoną PBS ostrożnie nałoży się na Ficoll i odwiruje w wirówce przy 400 g przez 30 minut. Warstwę PBMC następnie ekstrahuje się i przemywa dwukrotnie PBS i przechowuje w 10% roztworze do zamrażania sulfotlenku dimetylu w ciekłym azocie, aby można je było rozmrozić i analizować partie w późniejszym terminie.

Przykładowa analiza:

PBMC będą zliczane za pomocą hemocytometru, a następnie hodowane w RPMI i 10% surowicy z LPS, toksyną α lub niestymulowane przez 24 godziny, po czym zostaną natychmiast zanalizowane, jak wyszczególniono poniżej.

• Rozpuszczalne mediatory (osocze)

• Przechowywanie: Krew antykoagulowana kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA, BD Biosciences Vacutainer, 9 ml) zostanie odwirowana (1200 g, 10 minut, 20°C), a osocze będzie przechowywane w temperaturze -80°C w ciągu 2 godzin od pobrania
• Analiza:

Cytokiny: Meso Scale Discovery (MSD) V-PLEX Panel prozapalny 1 zostanie wykorzystany do ilościowego oznaczenia IFN-γ, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6 , IL-8 i TNF-α. Płytki będą odczytywane przy użyciu imagera MSD QuickPlex SQ 120 (Wiliam Harvey Institute, QMUL).

Przeciwciała: Będą one mierzone za pomocą testów ELISA przeciwko antygenom gronkowcowym (toksyna α, kwas teichojowy) i ugrupowaniom rdzeniowym cząsteczki endotoksyny (EndoCAb).

• Uwalnianie cytokin stymulowane LPS/toksyną α pełnej krwi

  • Technika: Jak wcześniej opisano i zatwierdzono w naszym laboratorium, heparynizowana krew będzie stymulowana przez 4 godziny (37°C, 250 obr./min) za pomocą 1 ng/ml LPS w ciągu 2 godzin od pobrania. Po inkubacji próbki zostaną odwirowane (1200 g, 10 min, 20°C) i supernatant będzie przechowywany w temperaturze -80°C.
  • Oznaczenie ilościowe cytokin: Zgodnie z „rozpuszczalnymi mediatorami” panel prozapalny MSD V-PLEX 1 zostanie zastosowany do ilościowego oznaczenia TNF-α (główny wynik jako miernik kompetencji immunologicznej) i innych cytokin. Cytokiny będą wyrażane jako współczynnik liczby krążących monocytów.

• Immunofenotypowanie metodą cytometrii przepływowej i ocena funkcjonalna leukocytów

  • Cytometria przepływowa: Wszystkie próbki będą analizowane na tej samej maszynie (Becton Dickinson (BD) Fortessa, Rayne Building, UCL). Standaryzacja i porównanie wyników zostanie osiągnięte poprzez zastosowanie stałych napięć i macierzy kompensacji przez cały czas z codziennym dopasowywaniem wartości do pojedynczej partii perełek do konfiguracji i śledzenia cytometrii (CS&T) (BD). Barwienie powierzchni komórek leukocytów zostanie przeprowadzone przy użyciu przeciwciał dostarczanych głównie przez firmę BD. Barwienie, gromadzenie i przechowywanie danych będzie przeprowadzane zgodnie ze standardową procedurą operacyjną pojedynczego badania. W każdym punkcie czasowym zostanie wykonanych 5 paneli (do 14 kolorów) i dwa testy czynnościowe. Dane będą analizowane w FlowJo w wersji 10.5.
  • Barwienie markerem powierzchniowym:

Panel do oznaczania ilościowego i kalibracji: CD45, CD56, CD3, CD4, CD8, CD19, CD14, CD16, wykonany w probówce BD TruCount w celu umożliwienia zliczenia podzbiorów komórek Panele specyficzne dla komórki (zawierające markery podkategorii i markery kompetencji immunologicznej)

• Monocyty/szpik: CD3, CD19, CD56, CD163, CD16, CD33, CD141, CD206, CD274, CD14, CD1c, CD11c, HLA-DR, CD80, CD123, CD83
• Neutrofile: CD3, CD19, CD56, HLA-DR, CD64, CD62L, CD11b, CD88, CD66b, CD14, CD11c, CD16, CD184, CD182

• Limfocyty: CD19, CCR6, CD45RA, CD3, CD4, CD8, CXCR3, CD127, CD62L, CD25, CD56, CD27, CD279 Ekspresja HLA-DR: Zostanie określona ilościowo na monocytach CD14+ przy użyciu perełek BD QuantiBrite.

  • Miary funkcjonalne Fagocytoza: Zdolność neutrofili i monocytów do fagocytozy opsonizowanych bakterii E.coli znakowanych FITC zostanie określona ilościowo za pomocą testu PhagoTest (BD) zgodnie z instrukcjami producenta. test PhagoBurst (BD) w odpowiedzi na nieznakowane opsonizowane E. coli, 12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA) i chemotaktyczny peptyd N-formylo-Met-Leu-Phe (fMLP).

o Komórki PBMC pobrane przed zabiegiem chirurgicznym, które będą stymulowane LPS (rodzaj i stężenie należy zoptymalizować za pomocą krzywej odpowiedzi na dawkę u zdrowych ochotników) i toksyną α, zostaną poddane cytometrii przepływowej w celu zmierzenia ekspresji powierzchniowej TLR4 i TLR5, ekspresji powierzchniowej HLA-DR i oznaczanie ilościowe NF-kB przy użyciu odpowiednich przeciwciał zwalidowanych w literaturze. Pod koniec stymulacji komórki zostaną zebrane i wyekstrahowany RNA do ilościowego (q)PCR w celu oceny ekspresji mRNA AID. Chociaż komórki B w hodowlach PBMC były stymulowane w obecności innych typów komórek, głównie komórek T i monocytów-makrofagów, naszym celem końcowym jest zmierzenie odpowiedzi komórek B, ponieważ AID ulega ekspresji wyłącznie w komórkach B.

Dostępna jest wystarczająca ilość zdrowej krwi ochotników, aby wszystkie powyższe techniki mogły zostać odpowiednio przećwiczone i zoptymalizowane przed rekrutacją pacjentów.

Dalsze punkty czasowe pobierania próbek będą miały miejsce bezpośrednio po operacji (T1), 24 godziny po operacji (T2), wypis (T3) i 4 tygodnie po operacji podczas wizyty kontrolnej (T4). Krew pobrana podczas 4-tygodniowej wizyty kontrolnej po operacji zostanie oznaczona na obecność przeciwciał IgG przeciwko EndoCAb, α-toksynie i kwasowi teichojowemu. Umożliwi to pomiar rekombinacji przełączania klas. Co będzie odnosić się do stopnia ekspresji mRNA AID.

Populacja pacjentów po wymianie zastawki aortalnej będzie monitorowana pod kątem śmiertelności i poważnych powikłań. Zostaną one ocenione zgodnie z C-POMS (ocena zachorowalności pooperacyjnej serca), długości pobytu w OIT i długości pobytu w szpitalu. Pacjenci będą monitorowani pod kątem rozwoju zakażenia miejsca operowanego (ZMO) lub nabycia pooperacyjnego zakażenia szpitalnego (HAI). Obserwacja po wypisie ze szpitala pod kątem zakażenia rany lub załamania będzie kontynuowana przez 12 miesięcy.

W punkcie czasowym bezpośrednio przed operacją (T0), oprócz obecnie akceptowanych pomiarów odpowiedzi immunologicznej, zamierza się wykonać test odpowiedzi immunologicznej przy pacjencie (LIT) przy użyciu ręcznego urządzenia do chemiluminescencji, które opiera się na impulsie oksydacyjnym leukocytów do supramaksymalnego bodźca (Oxford lekarka). Opiera się to na analizie odpowiedzi w 10 ml próbki świeżej krwi włośniczkowej.

Względy statystyczne:

Z opublikowanych danych z ośrodków na całym świecie wiadomo, że u części pacjentów po operacji zastawki aortalnej rozwija się infekcja, albo zakażenie miejsca operowanego (ZMO), albo zakażenie szpitalne (HAI). Wiadomo również, że pacjenci ci wytrzymują dłuższy pobyt w szpitalu po operacji.

Badacze wykazali, że wśród tych pacjentów występuje zmienność poziomów przeciwciał przeciwko różnym zagrożeniom okołooperacyjnym, a mianowicie endotoksynom i gronkowcom.

Badacze wykazali, że u pacjentów poddawanych zabiegom chirurgicznym z niskim poziomem krążących przeciwciał przeciwko endotoksynom i/lub gronkowcom istnieje związek z większym prawdopodobieństwem rozwoju infekcji i dłuższym pobytem pooperacyjnym. Badacze szacują, że wskaźnik infekcji waha się między 13,5 a 33%.

Badacze sugerowali wcześniej, że związek między poziomem przeciwciał a wynikiem może być przejawem upośledzonej zdolności niektórych osób do wywołania normalnej odpowiedzi immunologicznej na te zagrożenia.

Wiadomo, że część osób ma nieprawidłową odpowiedź immunologiczną. Jest to prawdopodobnie najbardziej widoczne w odpowiedzi na szczepienie, gdzie poprzednie prace wykazały brak odpowiedzi immunologicznej po różnych programach szczepień i naszej własnej pracy nad odpowiedzią EndoCAb na monowalentne szczepienie przeciw durowi brzusznemu. Ta słaba/brak reakcji w tych badaniach wynosi od 10 do 40%. Diagram ilustruje odsetek osób, które nie odpowiadają (tj. słabą odpowiedź immunologiczną), jeśli są one równomiernie rozmieszczone.