Immuunrespons en resultaat na aortaklepoperatie (meting) (Measure)

Experimenteel ontwerp en methoden:

Instelling:

Barts Heart Center is een gespecialiseerd hartcentrum met 255 bedden waar jaarlijks ongeveer 200 primaire geïsoleerde open aortaklepvervangingsprocedures worden uitgevoerd. Het is zowel geografisch als academisch nauw verbonden met het William Harvey Research Institute (WHRI), dat deel uitmaakt van de Queen Mary University, Londen (QMUL). Hierdoor kunnen laboratoriumanalyses van alle verzamelde bloedmonsters indien nodig binnen 15 minuten plaatsvinden. Barts Heart Centre is een van de grootste cardiale afdelingen in Europa en een belangrijke onderzoeksdoelstelling van QMUL/WHRI is het ondersteunen van cardiaal onderzoek.

Monsterverzameling en opslag:

Na schriftelijke geïnformeerde toestemming zullen alle patiënten preoperatief een risicoscore krijgen door middel van ASA, Euroscore 2 en een conventionele risicoscore voor de ontwikkeling van postoperatieve wondinfectie.

Direct voorafgaand aan de operatie (T0) zal bloed worden afgenomen (44 ml in totaal) van 150 aortaklepvervangende patiënten.

Bloed (7 ml) wordt verzameld in een PAXgene-buisje en bewaard bij -80° voor latere genetische analyse. Een geklonterd monster (7 ml) wordt verzameld in een standaard SST-buis met gouden dop, men laat het stollen en vervolgens wordt het 10 minuten gecentrifugeerd bij 1000 g, het serum wordt gescheiden en bewaard bij -80°C voor latere analyse van antilichaamniveaus. Daarnaast zal 30 ml bloed worden afgenomen voor onderzoek van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's), afgenomen in standaard EDTA-buisjes met paarse bovenkant (antistollingsmiddel). Deze worden binnen 3 uur na verzameling gescheiden door Ficoll-Paque dichtheidsgradiëntcentrifugatie, waarbij PBS-verdund bloed zorgvuldig over Ficoll wordt aangebracht en gedurende 30 minuten in een centrifuge bij 400 g wordt afgecentrifugeerd. De PBMC-laag wordt vervolgens geëxtraheerd en tweemaal gewassen in PBS en opgeslagen in 10% dimethylsulfoxide-bevriezingsoplossing in vloeibare stikstof zodat ze kunnen worden ontdooid en batchgewijs op een later tijdstip kunnen worden geanalyseerd.

Voorbeeldanalyse:

PBMC's worden geteld met behulp van een hemocytometer, vervolgens gekweekt in RPMI en 10% serum met LPS, α-toxine of ongestimuleerd gedurende 24 uur, waarna ze onmiddellijk worden geanalyseerd zoals hieronder beschreven.

• Oplosbare bemiddelaars (Plasma)

• Opslag: Ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA, BD Biosciences Vacutainer, 9 ml) ontstold bloed wordt gecentrifugeerd (1200 g, 10 minuten, 20°C) en het plasma wordt binnen 2 uur na afname bewaard bij -80°C
• Analyse:

Cytokines: Meso Scale Discovery (MSD) V-PLEX Proinflammatoir Panel 1 zal worden gebruikt om IFN-γ, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6 te kwantificeren , IL-8 en TNF-a. Platen worden gelezen met behulp van een MSD QuickPlex SQ 120 imager (Wiliam Harvey Institute, QMUL).

Antilichamen: deze zullen worden gemeten door middel van ELISA-assays tegen stafylokokkenantigenen (α-toxine, teichoïnezuur) en kerndelen van het endotoxinemolecuul (EndoCAb).

• Volbloed LPS/α-toxine Gestimuleerde cytokine-afgifte

  • Techniek: Zoals eerder beschreven en gevalideerd in ons laboratorium, wordt gehepariniseerd bloed gedurende 4 uur (37 °C, 250 rpm) gestimuleerd met 1 ng/ml LPS binnen 2 uur na afname. Na incubatie worden de monsters gecentrifugeerd (1200 g, 10 minuten, 20°C) en het supernatant wordt bij -80°C bewaard.
  • Cytokine-kwantificering: Volgens 'oplosbare mediatoren' zal MSD V-PLEX Pro-inflammatoir panel 1 worden gebruikt om TNF-α (primair resultaat als metriek van immuuncompetentie) en andere cytokines te kwantificeren. Cytokines zullen worden uitgedrukt als een factor van het aantal circulerende monocyten.

• Flowcytometrische immunofenotypering en functionele beoordeling van leukocyten

  • Flowcytometrie: alle monsters worden op dezelfde machine geanalyseerd (Becton Dickinson (BD) Fortessa, Rayne Building, UCL). Standaardisatie en vergelijking van output zal worden bereikt door gebruik te maken van constante spanningen en compensatiematrix met dagelijkse afstemming van waarden op een enkele batch Cytometry Setup and Tracking (CS&T) beads (BD). Kleuring van het celoppervlak van leukocyten zal worden uitgevoerd met behulp van antilichamen die voornamelijk door BD worden geleverd. Kleuring, gegevensverzameling en opslag zullen worden uitgevoerd in overeenstemming met een enkele standaardwerkwijze voor een studie. Op elk tijdstip worden 5 panelen (tot 14 kleuren) en twee functionele tests uitgevoerd. Gegevens worden geanalyseerd in FlowJo versie 10.5.
  • Oppervlaktemarkeringskleuring:

Kwantificatie- en kalibratiepanel: CD45, CD56, CD3, CD4, CD8, CD19, CD14, CD16, uitgevoerd in een BD TruCount-buis om telling van celsubsets mogelijk te maken Celspecifieke panelen (met markers van subcategorisatie en markers van immuuncompetentie)

• Monocyt/Myeloïde: CD3, CD19, CD56, CD163, CD16, CD33, CD141, CD206, CD274, CD14, CD1c, CD11c, HLA-DR, CD80, CD123, CD83
• Neutrofielen: CD3, CD19, CD56, HLA-DR, CD64, CD62L, CD11b, CD88, CD66b, CD14, CD11c, CD16, CD184, CD182

• Lymfocyt: CD19, CCR6, CD45RA, CD3, CD4, CD8, CXCR3, CD127, CD62L, CD25, CD56, CD27, CD279 HLA-DR-expressie: wordt gekwantificeerd op CD14+ monocyten met behulp van BD QuantiBrite-parels.

  • Functionele maatregelen Fagocytose: het vermogen van neutrofielen en monocyten om geopsoniseerde FITC-gelabelde E.coli-bacteriën te fagocyteren zal worden gekwantificeerd via de PhagoTest-assay (BD) volgens de instructies van de fabrikant Reactieve zuurstof 'burst': Kwantitatieve bepaling van leukocytenoxidatieve burst zal worden uitgevoerd met de PhagoBurst-assay (BD) als reactie op niet-gelabelde geopsoniseerde E.coli, forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) en het chemotactische peptide N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP).

o De PBMC's van het preoperatieve monster die zullen worden gestimuleerd met LPS (type en concentratie moeten worden geoptimaliseerd via dosis-responscurve bij gezonde vrijwilligers) en α-toxine zullen flowcytometrie ondergaan om TLR4- en TLR5-oppervlakte-expressie, HLA-DR-oppervlakte-expressie en kwantificering van NF-kB met behulp van geschikte antilichamen die in de literatuur zijn gevalideerd. Aan het einde van de stimulatie worden cellen geoogst en wordt RNA geëxtraheerd voor kwantitatieve (q)PCR om AID-mRNA-expressie te evalueren. Hoewel B-cellen in de PBMC-culturen zijn gestimuleerd in de aanwezigheid van andere celtypen, voornamelijk T-cellen en monocyten-macrofagen, is ons eindpunt het meten van een B-celrespons, aangezien AID uitsluitend tot expressie wordt gebracht in B-cellen.

Er is voldoende gezond vrijwilligersbloed beschikbaar zodat alle bovenstaande technieken adequaat kunnen worden geoefend en geoptimaliseerd voordat patiënten worden geworven.

Verdere bemonsteringstijdstippen zijn onmiddellijk postoperatief (T1), 24 uur postoperatief (T2), ontslag (T3) en 4 weken postoperatief bij chirurgische follow-up (T4). Het bloed dat 4 weken na de operatie wordt verzameld, zal worden getest op IgG-antilichaamtest tegen EndoCAb, α-toxine en teichoïnezuur. Dit zal een zekere mate van recombinatie van klassenwisselingen mogelijk maken. Wat terugverwijsbaar is naar de mate van expressie van AID-mRNA.

De populatie van aortaklepvervangende patiënten zal worden gevolgd op mortaliteit en ernstige morbiditeit. Ze worden gescoord volgens de C-POMS (cardiale postoperatieve morbiditeitsscore), de duur van het ITU-verblijf en de duur van het ziekenhuisverblijf. Patiënten zullen worden gecontroleerd op de ontwikkeling van een postoperatieve wondinfectie (POWI) of het oplopen van een postoperatieve ziekenhuisinfectie (HAI). De follow-up na ontslag voor wondinfectie of wondbeschadiging wordt gedurende 12 maanden voortgezet.

Op het onmiddellijk pre-operatieve tijdpunt (T0) is het, naast de momenteel geaccepteerde metingen van immuunresponsiviteit, bedoeld om een ​​near-patient test van immuunresponsiviteit (LIT) uit te voeren met behulp van een handheld chemiluminescentie-apparaat dat vertrouwt op oxidatieve burst van leukocyten tot een supramaximale stimulus (Oxford middelster). Dit berust op analyse van de respons in een 10mcl vers capillair bloedmonster.

Statistische overwegingen:

Uit gepubliceerde gegevens van centra over de hele wereld is bekend dat een deel van de patiënten een infectie ontwikkelt, ofwel postoperatieve wondinfectie (POWI) ofwel ziekenhuisinfectie (HAI), na een aortaklepoperatie. Het is ook bekend dat deze patiënten na een operatie langer in het ziekenhuis blijven.

De onderzoekers hebben aangetoond dat er bij deze patiënten variabiliteit is in de niveaus van antilichamen tegen verschillende perioperatieve bedreigingen, namelijk endotoxine en stafylokokken.

De onderzoekers hebben aangetoond dat bij de patiënten die een operatie ondergaan en lage niveaus van circulerend antilichaam tegen endotoxine en/of stafylokokken hebben, er een verband bestaat met een grotere kans op het ontwikkelen van een infectie en een langere duur van het postoperatieve verblijf. De onderzoekers schatten dat het infectiepercentage varieert tussen 13,5 en 33%.

De onderzoekers hebben eerder gesuggereerd dat de associatie tussen antilichaamniveau en uitkomst een manifestatie kan zijn van een onderliggend verminderd vermogen bij sommige individuen om een ​​normale immuunrespons op deze bedreigingen op te zetten.

Het is bekend dat een deel van de individuen een abnormale immuunrespons heeft. Dit is misschien het duidelijkst te zien in de respons op vaccinatie, waar eerder werk het gebrek aan immuunrespons heeft aangetoond na verschillende vaccinatieprogramma's en ons eigen werk aan de EndoCAb-respons op monovalente tyfusvaccinatie. Deze niet/slechte responsiviteit ligt in deze studies ergens tussen de 10 en 40%. Het diagram illustreert het aandeel non-responders (dwz slechte immuunrespons) als ze gelijk verdeeld zijn.